首先，在110， 000 G和4摄氏度的超速离心机中将FBS离心过夜，以去除内源性sEV。通过0.2微米超滤膜过滤上清液以产生不含sEVs的FBS，从而对上清液进行灭菌。接下来在150毫米培养皿中，将约3倍10的平板到20毫升DMEM培养基中的第七个永生化骨髓来源的巨噬细胞。
在从巨噬细胞中收集sEV之前，将培养皿在37摄氏度下在5%二氧化碳下孵育过夜。第二天，丢弃培养基后，用磷酸盐缓冲盐水或PBS洗涤细胞。在将细胞在 37 摄氏度和 5% 二氧化碳下孵育之前，用含有 10%无 sEVs 的无胎牛血清的 DMEM 替换培养基。
根据实验的要求，收集细胞的上清液并将其转移到50毫升离心管中。将试管以 300 G 离心 10 分钟以去除细胞。将上清液中的结果从每个管转移到新的50毫升离心管中并丢弃沉淀。
这一次，将上清液以2000G离心10分钟以除去死细胞。然后将上清液转移到新的高速离心管中并丢弃沉淀。接下来除去碎片和微泡，使用高速离心机将获得的上清液以10， 000G离心30分钟。
通过在每管中加入35毫升并丢弃沉淀，将所得的上清液转移到新的超速离心管中。将超速离心管在水平桶转子离心机中以110， 000G离心70分钟，然后丢弃上清液。用一毫升PBS清洗所得的富含sEVs的粗颗粒。
同样，将一毫升PBS添加到其中一个管中的洗涤沉淀中，并通过连续移液混合。将一毫升所得PBS悬浮液转移到另一个含有沉淀的试管中，并重复相同的操作，直到通过移液混合管中的所有沉淀。将所得的一毫升富含sEVs的PBS转移到新的超速离心管中。
然后将新管在台式超速离心机中以110， 000 G离心70分钟。丢弃上清液后，用100微升PBS洗涤所得的富含sEVs的粗沉淀。在标准蛋白质管中加入1.2毫升蛋白质制备溶液，以溶解其中存在的30毫克BSA。
用PBS稀释所得蛋白质标准溶液，使其浓度从每毫升25毫克降低到0.5毫克。将八种不同体积的稀释蛋白质标准溶液加入96孔板的孔中，并使用PBB使每个孔中的体积达到20微升。向样品孔中加入18微升HEPES裂解缓冲液，然后加入两微升sEV样品。
接下来，将按照制造商的说明制备的200微升BCA工作溶液添加到每个孔中。让板在室温下静置 20 到 30 分钟。最后，使用酶标仪测量562纳米处的吸光度。
使用获得的结果计算sEV中的总蛋白质含量。分离的sEV的透射电子显微镜图像显示出典型的杯状形态。纳米颗粒跟踪分析表明，分离出的sEV主要集中在136纳米处。
蛋白质印迹显示，分离的sEV显著富集了sEVs标志物，包括CD9、β-肌动蛋白和TSG101。仅在全细胞裂解物中检测到内质网状标记物GRP94。结果表明，所采用的方法产生了具有高纯度的sEV。
