Iniziare a isolare le cellule mononucleate del sangue periferico accedendo al buffy coat umano e trasferendo sette millilitri in un tubo conico sterile da 15 millilitri. Aggiungere sei millilitri di soluzione PBS per un lavaggio preliminare. Centrifugare la provetta per 10 minuti a 1,100 G in una centrifuga con rotore oscillante e spegnere a temperatura ambiente.
Raccogliere la sospensione leucocitaria utilizzando una pipetta Pasture e trasferirla in una nuova provetta conica sterile da 15 millilitri. Aggiungere la soluzione di PBS alla sospensione leucocitaria fino a raggiungere i 10 millilitri e mescolare delicatamente pipettando su e giù. Successivamente, preparare la soluzione a gradiente di densità inserendo tre millilitri di mezzo a gradiente di densità in una nuova provetta conica sterile da 15 millilitri.
Lasciare che raggiunga la temperatura ambiente. Aggiungere lentamente cinque millilitri di sospensione leucocitaria diluita sulle pareti coniche del tubo contenente il mezzo del gradiente di densità per creare una separazione del gradiente di densità da cinque a tre. Evitare di disturbare il fluido.
Procedere alla separazione del gradiente centrifugando la sospensione presente nel mezzo a gradiente di densità utilizzando una centrifuga con rotore oscillante e il freno disinserito. Successivamente, trasferire con cura fino a 25 millilitri del sottile strato di PBMC in una nuova provetta conica da 50 millilitri riempita di PBS utilizzando una pipetta Pasture e mescolarla bene per rimuovere cellule residue e detriti, centrifugare i campioni a temperatura ambiente per 10 minuti a 600 G con un freno normale. Scartare il surnatante e riempire il campione a 10 millilitri utilizzando PBS.
Prendi un'aliquota per contare le celle. Per rimuovere le piastrine, centrifugarle con un normale freno e capovolgere con cura la provetta per scartare il surnatante. Per l'isolamento positivo del CD14 dei monociti mediante selezione cellulare attivata magneticamente, risospendere il pellet cellulare nel tampone delle microsfere e nelle microsfere immunomagnetiche CD14.
Incubare la sospensione cellulare per 15 minuti a quattro gradi Celsius. Per rimuovere le perle non legate, aggiungere uno o due millilitri di tampone di microsfere per una volta 10 alla settima cellula prima di centrifugare la sospensione a temperatura ambiente per 10 minuti a 600 G. Quindi capovolgere con cautela la provetta per scartare il surnatante. Preparare la colonna LS e posizionarla sul magnete prima dell'uso.
Sciacquare con tre millilitri di tampone di microsfere e risospendere immediatamente il pellet cellulare in 500 microlitri di tampone di microsfere per una volta 10 all'ottava cellula. Aggiungere la sospensione cellulare all'ingresso della colonna LS e raccogliere la frazione cellulare negativa in un tubo conico da 15 millilitri sotto l'uscita della colonna. Lavare la colonna tre volte con tre millilitri di tampone per microsfere.
Dopo il lavaggio finale, rimuovere la colonna dal magnete e posizionarla su una provetta conica sterile da 15 millilitri. Pipettare cinque millilitri di tampone di microsfere nell'ingresso della colonna. Inserire immediatamente lo stantuffo della siringa riempito con le cellule target nell'ingresso della colonna ed erogare le cellule nella colonna.
Quindi centrifugare le frazioni cellulari CD14 negative e CD14 positive ed eliminare il surnatante. Per la differenziazione dei monociti in cellule dendritiche derivate da monociti umani, preparare una sospensione cellulare contenente 1,3 volte 10 al sesto cellule per millilitro aggiungendo il volume appropriato di mezzo di differenziazione alle cellule CD14 positive. Risospendere i monociti pipettando con una pipetta Pasture.
Dopo aver placcato la sospensione da 1,3 volte 10 a sesta cellula per millilitro per pozzetto di una piastra a 24 pozzetti, incubare in un incubatore di coltura a 37 gradi Celsius con anidride carbonica al 5%. Cambiare il terreno di coltura e integrarlo con citochine fresche ogni due o tre giorni. Per raccogliere le cellule differenziate, trasferire l'intera sospensione cellulare in una provetta conica sterile utilizzando una micropipetta e lavare due volte il pallone di coltura con PBS.
Dopo aver centrifugato le provette coniche a temperatura ambiente per 10 minuti a 180 G, risospendere il pellet nel terreno o nel tampone appropriato per la configurazione sperimentale. Durante la differenziazione dei monociti, la stimolazione dell'interleuchina 4 e del fattore stimolante le colonie di macrofagi granulocitari ha modificato il fenotipo cellulare. I dati hanno mostrato che le cellule dendritiche derivate da monociti umani hanno perso l'espressione del marcatore di superficie CD14, espresso principalmente dai monociti, e hanno guadagnato un'espressione significativa di CD1A.
un marcatore espresso dalle cellule dendritiche umane. Le cellule dendritiche derivate dai monociti umani ottengono anche una maggiore espressione di MHC2 HLA-DR, una molecola che presenta l'antigene espressa dalle cellule dendritiche umane e da altre cellule presentanti l'antigene.
