शुरू करने के लिए, नील लाल पाउडर को एसीटोन में तीन मिलीग्राम प्रति मिलीलीटर एकाग्रता पर घोलें। आवधिक मिश्रण के साथ कमरे के तापमान पर 15 मिनट के लिए घोल को इनक्यूबेट करें। घोल में शेष अवक्षेप की मात्रा के आधार पर एक या दो बार 0.22-माइक्रोमीटर फ़िल्टर का उपयोग करके समाधान को फ़िल्टर करें।
फिर डीपीबीएस में एक-से-500 अनुपात में स्टॉक समाधान को पतला करके कार्यशील समाधान तैयार करें। पैराफॉर्मलडिहाइड-फिक्स्ड आरपीई कोशिकाओं में काम करने वाले समाधान के 200 माइक्रोलीटर जोड़ें और प्रकाश से बचाने वाले शेकर पर कमरे के तापमान पर 30 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें। इनक्यूबेशन बाद, डीपीबीएस के साथ दो बार नमूने धोएं, फिर डीपीबीएस के 200 माइक्रोलीटर जोड़ें, और उन्हें चार डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
बीओडीआईपीवाई धुंधला करने के लिए, निर्जल डीएमएसओ में बीओडीआईपीवाई को घोलकर 3.8-मिलीमोलर स्टॉक एकाग्रता तैयार करें। फिर डीपीबीएस में एक-से-300 अनुपात में स्टॉक समाधान को पतला करके कार्यशील समाधान तैयार करें। बीओडीआईपीवाई के कामकाजी समाधान के 200 माइक्रोलीटर को पैराफॉर्मलडिहाइड-फिक्स्ड आरपीई कोशिकाओं में जोड़ें और कमरे के तापमान पर एक रॉकर पर रात भर इनक्यूबेट करें।
अगले दिन, डीपीबीएस के साथ दो बार कोशिकाओं को धोएं और उन्हें चार डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत करने से पहले 200 माइक्रोलीटर डीपीबीएस जोड़ें। एपीओई इम्यूनोस्टेनिंग के लिए, डीपीबीएस को 1% बीएसए, 0.5% ट्वीन 20 और 0.5% ट्राइटन एक्स -100 के साथ मिलाकर एक बफर समाधान तैयार करें। एक घंटे के लिए 200 माइक्रोलीटर बफर समाधान में पैराफॉर्मलडिहाइड-फिक्स्ड आरपीई कोशिकाओं को ब्लॉक और परमेबिलाइज करें।
इनक्यूबेशन बाद, बफर समाधान में एक से -100 पर पतला सेब प्राथमिक एंटीबॉडी जोड़ें और कमरे के तापमान पर रात भर इनक्यूबेट करें। अगले दिन, डीपीबीएस के साथ दो बार नमूने धो लें। फिर कमरे के तापमान पर एक घंटे के लिए एक से -1000 पर पतला 200 माइक्रोलीटर द्वितीयक एंटीबॉडी समाधान जोड़ें।
इनक्यूबेशन के बाद, कोशिकाओं को डीपीबीएस के साथ दो बार धोएं और उन्हें चार डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत करने से पहले 200 माइक्रोलीटर डीपीबीएस जोड़ें।
