Per iniziare, sciogliere la polvere di Nile Red in acetone a una concentrazione di tre milligrammi per millilitro. Incubare la soluzione per 15 minuti a temperatura ambiente con miscelazione periodica. Filtrare la soluzione utilizzando un filtro da 0,22 micrometri una o due volte a seconda della quantità di precipitato rimanente nella soluzione.
Quindi preparare la soluzione di lavoro diluendo la soluzione madre in un rapporto di uno a 500 in DPBS. Aggiungere 200 microlitri della soluzione di lavoro alle cellule RPE fissate con paraformaldeide e incubare per 30 minuti a temperatura ambiente su un agitatore al riparo dalla luce. Dopo l'incubazione, lavare i campioni due volte con DPBS, quindi aggiungere 200 microlitri di DPBS e conservarli a quattro gradi Celsius.
Per la colorazione di BODIPY, preparare una concentrazione di 3,8 millimolari sciogliendo BODIPY in DMSO anidro. Quindi preparare la soluzione di lavoro diluendo la soluzione madre in un rapporto di uno a 300 in DPBS. Aggiungere 200 microlitri della soluzione di lavoro di BODIPY alle cellule RPE fissate con paraformaldeide e incubare per una notte su un bilanciere a temperatura ambiente.
Il giorno successivo, lavare le cellule due volte con DPBS e aggiungere 200 microlitri di DPBS prima di conservarle a quattro gradi Celsius. Per l'immunocolorazione APOE, preparare una soluzione tampone combinando DPBS con 1%BSA, 0,5%Tween 20 e 0,5%Triton X-100. Bloccare e permeabilizzare le cellule RPE fissate con paraformaldeide in 200 microlitri di soluzione tampone per un'ora.
Dopo l'incubazione, aggiungere l'anticorpo primario APPLE diluito a 1 a 100 nella soluzione tampone e incubare per una notte a temperatura ambiente. Il giorno seguente, lavare i campioni due volte con DPBS. Quindi aggiungere 200 microlitri di soluzione anticorpale secondaria diluita a 1 a 1000 per un'ora a temperatura ambiente.
Dopo l'incubazione, lavare le cellule due volte con DPBS e aggiungere 200 microlitri di DPBS prima di conservarle a quattro gradi Celsius.
