For å begynne, oppløs Nile Red pulver i aceton ved tre milligram per milliliter konsentrasjon. Inkuber løsningen i 15 minutter ved romtemperatur ved periodisk blanding. Filtrer løsningen med et 0,22 mikrometer filter en eller to ganger, avhengig av mengden bunnfall som er igjen i løsningen.
Forbered deretter arbeidsløsningen ved å fortynne stamløsningen i forholdet mellom en og 500 i DPBS. Tilsett 200 mikroliter av arbeidsløsningen til de paraformaldehydfaste RPE-cellene og inkuber i 30 minutter ved romtemperatur på en shaker som beskytter mot lys. Etter inkubering, vask prøvene to ganger med DPBS, tilsett deretter 200 mikroliter DPBS, og oppbevar dem ved fire grader Celsius.
For BODIPY-farging, lag en 3,8 millimolar stamkonsentrasjon ved å oppløse BODIPY i vannfri DMSO. Forbered deretter arbeidsløsningen ved å fortynne stamløsningen i forholdet mellom en og 300 i DPBS. Tilsett 200 mikroliter av arbeidsløsningen av BODIPY til paraformaldehydfikserte RPE-celler og inkuber over natten på en rocker ved romtemperatur.
Neste dag, vask cellene to ganger med DPBS og tilsett 200 mikroliter DPBS før du lagrer dem ved fire grader Celsius. For APOE-immunfarging, klargjør en bufferløsning ved å kombinere DPBS med 1% BSA, 0,5% mellom 20 og 0,5% Triton X-100. Blokker og permeabiliser de paraformaldehydfikserte RPE-cellene i 200 mikroliter bufferløsning i en time.
Etter inkubering, tilsett APPLE primære antistoff fortynnet ved en-til-100 i bufferløsningen og inkuber over natten ved romtemperatur. Neste dag, vask prøvene to ganger med DPBS. Deretter tilsettes 200 mikroliter sekundær antistoffoppløsning fortynnet ved en-til-1000 i en time ved romtemperatur.
Etter inkubering, vask cellene to ganger med DPBS og tilsett 200 mikroliter DPBS før du lagrer dem ved fire grader Celsius.
