컨포칼 현미경과 40X 대물렌즈를 사용하여 사용된 지질 마커에 적합한 형광 채널로 스캔 프로파일을 생성합니다. 획득 모드와 채널을 설정한 후 소프트웨어 자동 초점을 클릭하여 초점 전략을 최적화합니다. 그런 다음 Z 스택의 범위를 20미크론으로 설정합니다.
그런 다음 타일을 최적화하고 뷰어를 열어 타일 위치를 선택합니다. 다음으로, 배치 이미지 처리 방법을 사용하여 확장된 초점 심도 방법으로 각 Z 스택의 최대 투영을 생성합니다. 이미지를 내보내기 전에 압축을 없음으로 설정하고 원본 데이터가 선택되어 있는지 확인하십시오.
결과 이미지는 형광 채널만의 최대 투영 그레이 스케일 TIFF로, 지질 마커를 표현합니다. Nile Red, BODIPY 또는 APOE를 나타내는 TIFF 이미지를 식별하고 사용 중인 방법에 따라 Nile Red, BODIPY 또는 APOE라는 디렉터리 내의 Images 폴더로 이동합니다. 지질 단위 소프트웨어를 엽니다.
Predict 탭에서 줄임표를 클릭하고 명명된 디렉터리로 이동하여 관련 디렉터리를 선택합니다. 지질 단위가 클래스 항목을 확인하여 이미지를 올바르게 식별했는지 확인합니다. 예측(Predict)을 클릭하여 작업 진행 상황을 관찰한 다음, 마스크 분석(Mask Analysis) 도구를 사용하여 생성된 마스크를 반복하고 마스크 이미지에서 임계값 지질 침전물의 정량적 개수를 제공합니다.
RPE의 성공적인 분화 및 성숙은 색소 침착 및 다각형 형태와 합류하는 단층을 보여주었습니다. 대조적으로, 실패한 분화는 죽어가는 세포의 클러스터를 보여주었습니다. 형광 이미지에서, 나일 레드(Nile Red)와 보디피(BODIPY) 퇴적물은 작고 밝은 원형 점으로 나타났다.
음성 결과는 약한 염색 또는 높은 배경 강도로 인해 배경 형광을 침전물로 착각하여 잘못된 이미지 분할을 보여줍니다. APOE 침전물의 크기, 모양 및 신호 강도가 다양하고 변동을 최소화하기 위해 염색 및 이미징 방법의 최적화가 필요한 것으로 나타났습니다.