Per iniziare, spruzzare accuratamente il topo maschio nero C57 6J di 10 settimane sacrificato con etanolo al 70%. Usando una pinza, rimuovi la pelle dall'arto posteriore e seziona tutti i muscoli degli arti che circondano il femore, la tibia e il perone. Posizionare i muscoli degli arti raccolti in una provetta da due millilitri contenente un millilitro di tampone di isolamento muscolare.
E usando le forbici, trita i muscoli raccolti. Trasferire la sospensione muscolare tritata in una provetta da 50 millilitri contenente 18 millilitri di tampone per l'isolamento muscolare. Chiudere bene il tubo, sigillarlo con pellicola da laboratorio e posizionarlo orizzontalmente in un bagnomaria agitato.
Dopo 30 minuti, aggiungere cinque milligrammi di collagenasi di tipo I e mantenere il tubo per altri 30 minuti. Dopo aver pipettato la sospensione muscolare su e giù per 10 volte, centrifugare ed eliminare il surnatante, lasciando cinque millilitri di terreno nella provetta. Pipettare la sospensione sui filtri cellulari successivi e raccogliere il flusso nella provetta da 50 millilitri.
Centrifugare la sospensione ed eliminare il surnatante fino a quando nella provetta rimangono solo 100-200 microlitri. Risospendere il pellet in due millilitri di tampone di lisi dei globuli rossi e incubare su ghiaccio per tre minuti. Centrifugare di nuovo e rimuovere il surnatante dalla provetta utilizzando una pipetta da 20 a 200 microlitri.
Risospendere il pellet in 100 microlitri di tampone FACS freddo e posizionare il tubo sul ghiaccio. Dopo aver rimosso 10 microlitri di sospensione cellulare per il controllo negativo, centrifugare i restanti 90 microlitri ed eliminare il surnatante prima di incubare le cellule con 400 microlitri di colorante di vitalità fissabile diluito in DMEM senza siero per 15 minuti a temperatura ambiente. Dopo la centrifugazione, aggiungere 100 microlitri di tampone FACS e capovolgere delicatamente la provetta tre volte.
Centrifugare di nuovo e aggiungere 100 microlitri di miscela di anticorpi primari nella provetta. Dopo 30 minuti di incubazione al buio, centrifugare ed eliminare il surnatante. Quindi aggiungere 500 microlitri di PBS per lavare le cellule.
Centrifugare nuovamente e rimuovere il surnatante prima di risospendere il pellet in 500 microlitri di tampone FACS. Trasferire la sospensione in un tubo da cinque millilitri. Vorticare brevemente la sospensione cellulare prima di elaborarla su un citometro a flusso.
Raccogliere le cellule selezionate nella provetta rivestita da cinque millilitri contenente il tampone FACS. Il 75% delle cellule mononucleate identificate in base alle loro dimensioni e granularità è risultato negativo per il marcatore di colorazione di vitalità fissabile, portando a una media del 34,3% di cellule vive. Circa il 3% delle singole cellule viventi è risultato negativo per i marcatori specifici dei monociti, degli endoteliali, dei leucociti e degli eritroidi.
Queste cellule negative sono state poi selezionate in base alla loro espressione dei marcatori CD34 e ITGA7. È stato eseguito un gating finale per CXCR4 per selezionare le cellule satelliti putative. E dalle cellule CD34-positive ITGA7-positive, l'80% è risultato positivo per CXCR4.
