Um den Assay mit dem Thrombozytenrezeptor-Agonisten Collagen-Related Peptide Cross-Linked (CRPXL) zu beginnen, wird eine geeignete Menge des CRPXL-Stamms im Assay-Puffer auf eine Konzentration verdünnt, die geeignet ist, eine maximale Thrombozytenaggregation zu induzieren. Die daraus resultierende Lösung wird fortan als Standard bezeichnet. Als nächstes werden ausgehend von den gleichen höchsten hergestellten Konzentrationen nacheinander zweifache serielle Verdünnungen sowohl für das Standard- als auch für das Testreagenz durchgeführt.
Bereiten Sie eine Verdünnungsreihe von sechs bis acht Punkten sowohl für den Test als auch für den Standard im Assay-Puffer vor, die Aggregationsreaktionen von 100 % bis 0 % erzeugt. Wenn das plättchenreiche Plasma (PRP) gebrauchsfertig ist, geben Sie ein Aliquot von PRP in die Küvette für die Lichttransmissionsaggregometrie. Lassen Sie die Proben einige Minuten lang auf 37 Grad Celsius in den Auffangwannen erwärmen. Sobald sie entsprechend erwärmt sind, legen Sie die Küvetten in das Aggregometer, um mit der Aufzeichnung der Spuren zu beginnen.
Fügen Sie unter ständigem Rühren den Agonisten hinzu und zeichnen Sie die Daten auf. Führen Sie eine Datenerfassung für jede vorbereitete Verdünnung des Standards und des Testreagenzes durch. Verwenden Sie Graphpad Prism oder ein geeignetes Softwarepaket, um zu überprüfen, ob die Konzentrationskurven für den Standard und den Test parallel sind.
Geben Sie die Daten so ein, dass die x-Achse die Konzentrationen und die y-Achse die Antwortvariablen enthält, die entweder durch den Prozentsatz der maximalen Aggregation oder die Fläche unter der Kurve angegeben werden. Transformieren Sie als Nächstes die Konzentrationswerte in die entsprechenden Logarithmen oder die logarithmische Konzentration. Wählen Sie die nichtlineare Regression aus den Analysefunktionen aus, und verwenden Sie die Gleichung für die Dosis-Wirkungs-Stimulation.
Wählen Sie logarithmische Agonisten- und Antwortvariablensteigung aus, und verwenden Sie eine drei- oder vierfache Anpassung, je nachdem, welche für die Daten am besten geeignet ist. Ermitteln Sie, ob die generierten Kurven parallel sind, indem Sie auf die Registerkarte Vergleichen klicken und die Datasets vergleichen. Stellen Sie sicher, dass die Steigung und die Asymptoten des Tests und die Standardkurven äquivalent sind.
Wenn diese Bedingungen erfüllt sind, fahren Sie mit der Berechnung der Potenz oder EC50 unter Verwendung der nichtlinearen Regressionskurvenanpassung fort. Berechnen Sie die relative Wirksamkeit, indem Sie den EC50-Wert des Standards durch den Wert des Tests dividieren. Passen Sie die Massen-pro-Volumen-Konzentration des Testreagenzes an, um den Unterschied in der Wirksamkeit in Bezug auf den Standard zu berücksichtigen.
Die Thrombozytenaggregationsspuren für das Standard- und das Testreagenz zeigten den Unterschied zwischen den beiden Aggregationsreaktionen. Mit 0,075 Mikrogramm pro Milliliter zeigte sich ein deutliches Ansprechen auf den Standard, während die entsprechende Konzentration im Test keine Reaktion zeigte. Die EC50-Werte des Standard- und Testreagenzes wurden durch Auftragen der Konzentrations-Wirkungs-Kurve berechnet.
