Per iniziare il test utilizzando l'agonista del recettore piastrinico, Collagen-Related Peptide Cross-Linked, o CRPXL, diluire una quantità appropriata dello stock di CRPXL nel tampone del saggio a una concentrazione adatta a indurre la massima aggregazione piastrinica. La soluzione risultante sarà d'ora in poi indicata come standard. Successivamente, partendo dalle stesse concentrazioni più elevate preparate, eseguire in sequenza due diluizioni seriali sia per lo standard che per il reagente in esame.
Preparare una serie di diluizioni da sei a otto punti sia per il test che per lo standard nel tampone del saggio che genera risposte di aggregazione dal 100% allo 0%Quando il plasma ricco di piastrine, o PRP, è pronto per l'uso, aggiungere un'aliquota di PRP nella cuvetta di aggregometria a trasmissione luminosa. Lasciare che i campioni si riscaldino a 37 gradi Celsius nei pozzetti di conservazione per un paio di minuti. Una volta riscaldate in modo appropriato, posizionare le cuvette nell'aggregometro per iniziare a registrare le tracce.
Agitando costantemente, aggiungere l'agonista e registrare i dati. Eseguire la raccolta dei dati per ogni diluizione preparata dello standard e del reagente in esame. Utilizzare Graphpad Prism, o qualsiasi pacchetto software adatto, per verificare che le curve di concentrazione per lo standard e il test siano parallele.
Immettere i dati in modo che l'asse x contenga le concentrazioni e l'asse y contenga le risposte indicate dalla percentuale di aggregazione massima o dall'area sotto la curva. Quindi, trasforma i valori di concentrazione nei logaritmi corrispondenti o concentrazione logaritmica. Selezionare la regressione non lineare dalle funzioni di analisi e utilizzare l'equazione per la stimolazione dose-risposta.
Selezionare l'agonista logaritmico rispetto alla pendenza variabile di risposta e utilizzare un adattamento a tre o quattro vie, a seconda di quale sia il migliore per i dati. Per determinare se le curve generate sono parallele, fare clic sulla scheda di confronto e confrontare i set di dati. Assicurarsi che la pendenza e gli asintoti della prova e le curve standard siano equivalenti.
Se queste condizioni sono soddisfatte, procedere al calcolo della potenza, o EC50, utilizzando l'adattamento della curva di regressione non lineare. Calcolare la potenza relativa dividendo il valore EC50 dello standard per quello del test. Regolare la concentrazione di massa per volume del reagente in esame per tenere conto della differenza di potenza rispetto allo standard.
Le tracce di aggregazione piastrinica per lo standard e il reagente di prova hanno rivelato la differenza tra le due risposte di aggregazione. A 0,075 microgrammi per millilitro, c'è stata una chiara risposta allo standard, mentre, per il test, la concentrazione corrispondente non ha mostrato alcuna risposta. I valori EC50 dello standard e del reagente in esame sono stati calcolati tracciando la curva concentrazione-risposta.
