Чтобы начать анализ с использованием агониста рецепторов тромбоцитов, Collagen-Related Peptide Cross-Linked, или CRPXL, разбавьте соответствующее количество запаса CRPXL в буфере для анализа до концентрации, подходящей для индуцирования максимальной агрегации тромбоцитов. Полученное решение отныне будет называться стандартом. Далее, начиная с тех же самых высоких подготовленных концентраций, последовательно выполняют двукратные последовательные разведения как для стандартного, так и для испытуемого реагента.
Подготовьте серию разбавлений по шести-восьми точкам как для теста, так и для стандарта в буфере для анализа, которая генерирует агрегационные реакции от 100% до 0%Когда обогащенная тромбоцитами плазма, или PRP, готова к использованию, добавьте аликвоту PRP в кювету для агрегометрии светопропускания. Дайте образцам нагреться до 37 градусов Цельсия в колодцах для выдержки в течение нескольких минут. После того, как кюветы должным образом нагреются, поместите их в агрегатометр, чтобы начать запись следов.
При постоянном помешивании добавляют агонист и записывают данные. Выполните сбор данных для каждого приготовленного разведения стандарта и испытуемого реагента. Используйте Graphpad Prism или любой подходящий программный пакет, чтобы убедиться, что кривые концентрации для стандарта и теста параллельны.
Введите данные таким образом, чтобы ось X содержала концентрации, а ось Y содержала ответы, обозначенные либо процентом максимальной агрегации, либо площадью под кривой. Затем преобразуйте значения концентрации в соответствующие логарифмы, или логарифмическую концентрацию. Выберите нелинейную регрессию из функций анализа и используйте уравнение для стимуляции зависимости от дозы.
Выберите логарифмический агонист в зависимости от наклона переменной отклика и используйте трех- или четырехстороннюю аппроксимацию в зависимости от того, что лучше для данных. Определите, являются ли созданные кривые параллельными, щелкнув вкладку сравнения и сравнив наборы данных. Убедитесь, что наклон и асимптоты теста, а также стандартные кривые эквивалентны.
Если эти условия выполнены, приступайте к расчету потенции, или EC50, используя нелинейную аппроксимацию кривой регрессии. Рассчитайте относительную эффективность, разделив значение EC50 стандарта на значение теста. Отрегулируйте массовую на объемную концентрацию испытуемого реагента, чтобы учесть разницу в эффективности по сравнению со стандартом.
Следы агрегации тромбоцитов для стандарта и тест-реагента выявили разницу между двумя реакциями агрегации. При 0,075 микрограмма на миллилитр наблюдался четкий ответ на стандарт, в то время как для теста соответствующая концентрация не показала никакого ответа. Значения EC50 стандартного и испытуемого реагента рассчитывали путем построения кривой реакции на концентрацию.