preparation of cnv mouse model for indocyanine green angiography (igca) and fluorescein angiography (fa)

Caratterizzazione di diversi tipi di lesioni di CNV indotta da laser nel topo

Age-related macular degeneration (AMD) is a prevalent condition that leads to severe vision loss in older individuals1. In the United States alone, the number of AMD patients is projected to double, reaching nearly 22 million by 2050, compared to the current 11 million. Globally, the estimated number of AMD cases is expected to reach a staggering 288 million by 20402.
Choroidal neovascularization (CNV), also known as &#34;wet&#34; or neovascular AMD, can have devastating effects on vision due to the formation of abnormal blood vessels beneath the central retina. This leads to hemorrhaging, retinal exudation, and significant vision loss. The introduction of anti-vascular endothelial growth factor (VEGF) therapies, which target extracellular VEGF, has revolutionized CNV treatment. However, despite these advancements, up to 50% of patients exhibit suboptimal responses to these therapies, with ongoing disease activity such as fluid accumulation and unresolved or new hemorrhages3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14.
Clinical studies have indicated that anti-VEGF resistance in CNV patients often corresponds to the presence of arteriolar CNV, characterized by large-caliber branching arterioles, vascular loops, and anastomotic connections9. Repeated anti-VEGF treatment can contribute to vessel abnormalization, the development of arteriolar CNV, and ultimately, resistance to anti-VEGF therapies14,15. In cases of arteriolar CNV, persistent fluid leakage is likely due to heightened exudation caused by inadequately formed tight junctions at arteriovenous anastomotic loops, particularly under conditions of high blood flow9. Conversely, individuals who respond well to anti-VEGF treatment tend to exhibit capillary CNV.
In our studies using animal models, we have demonstrated that laser-induced CNV in older mice develops arteriolar CNV and shows resistance to anti-VEGF treatment16,17. Conversely, laser-induced CNV in younger mice leads to the development of capillary CNV and high responsiveness to anti-VEGF treatment. Thus, it is crucial to differentiate between CNV vascular types for both mechanistic and therapeutic investigations.
In clinical settings, CNV is commonly classified based on fluorescein angiography (FA) leakage patterns (e.g., Type 1, Type 2), which use fluorescein dye to track exudation and identify areas of pathological leakage. In AMD research, CNV is predominantly studied using FA in animal models. However, FA fails to reveal the vascular morphology of CNV. Moreover, FA only captures images in the visible light spectrum and cannot visualize the choroidal vasculature beneath the retinal pigment epithelium (RPE). In contrast, indocyanine green (ICG), which exhibits strong affinity for plasma proteins, facilitates predominant intravascular retention and enables visualization of vascular structure and blood flow9. By utilizing the near-infrared fluorescence property of ICG, it becomes feasible to image the retinal and choroidal pigment using ICG angiography (ICGA). In this context, a protocol is presented that combines FA and ICGA to investigate the leakage and vascular morphology of laser-induced choroidal neovascularization (CNV) in young and old mice, where capillary and arteriolar CNV are observed.

Autore in primo piano: Superare la resistenza anti-VEGF attraverso la valutazione avanzata della morfologia vascolare nella neovascolarizzazione coroideale

Caratterizzazione della morfologia vascolare della degenerazione maculare neovascolare legata all'età mediante angiografia con verde indocianina

We are working on the mechanism and treatment strategies of age-related macular degeneration, a prevalent condition causing severe vision loss in older individuals. Particularly, we're developing new treatments to tackle the issue of drug resistance to the current treatment of corneal neovascularization, which is the wet type of AMD. Our lab recently developed new treatment to ameliorate anti-VEGF resistance in CNV.This is achieved by using mouse CNV model. Our research has shown that old mice with laser-induced CNV develop arteriolar CNV, which is resistant to anti-VEGF treatment. In contrast, young mice with capillary CNV are responsive to the treatment.In AMD research, CNV is almost exclusively studied by fluorescein angiography to reveal leakage patterns in animal models. However, FA does not show CNV vascular morphology, and thus it is not suitable to study anti-VEGF resistance in AMD. The current FA method used for CNV imaging lacks vital information regarding the vascular morphology of CNV lesions, such as capillary or arteriolar CNV.However, by combining ICGA and FA, this protocol can evaluate both CNV leakage and vascular morphology. By assessing both leakage and CNV lesion morphology, it is possible to study the underlying molecule mechanism relating to arteriolar CNV, and therefore provide opportunities to find new targets to treat anti-VEGF resistance for AMD patients.

Preparazione di un modello murino CNV per l'angiografia con verde indocianina (IGCA) e l'angiografia con fluoresceina (FA)

Dopo aver anestetizzato il topo, pizzica delicatamente una delle zampe del topo per verificare se il topo è adeguatamente anestetizzato. Somministrare gocce di soluzione oftalmica all'1% di tropicamide per dilatare gli occhi del topo e attendere 30 secondi. Quindi, per ridurre il movimento degli occhi e il battito delle palpebre, applicare gocce di cloridrato allo 0,5% di proparacaina su entrambi gli occhi, seguite da gocce di gel per gli occhi lubrificanti e posizionare il mouse su un cuscinetto d'acqua riscaldante.Preparare una miscela colorante contenente un volume uguale di verde indocianina, o ICG, e colorante fluoresceina. Iniettare 250 microlitri della miscela attraverso un'iniezione intraperitoneale nel quadrante inferiore sinistro vicino alle zampe posteriori del topo, posizionandolo parallelamente alla pelle per prevenire la perforazione dell'organo. Ritrarre con cautela lo stantuffo, assicurandosi che il sangue non sia entrato nel cappuccio della siringa.Procedere iniettando gradualmente il colorante a ritmo costante. Quindi, posiziona il mouse sul termoforo della piattaforma di imaging. Regola la posizione del corpo del mouse con un angolo di 45 gradi rispetto alla fotocamera e inclina delicatamente la testa leggermente verso il basso.Strofinare delicatamente l'occhio da riprendere utilizzando un batuffolo di cotone per rimuovere lo strato di colliri o gel lubrificanti. Spostare la telecamera verso l'occhio del mouse e selezionare il canale FA dal modulo di acquisizione. Disporre la testa del mouse in modo che il nervo ottico sia centrato sullo schermo, evitando la necessità di inclinare l'oftalmoscopio a scansione laser.Passare ora al canale ICGA sul modulo di acquisizione. Una volta che l'occhio occupa l'intero schermo sul software di imaging, ruotare il pulsante nero rotondo sul modulo di acquisizione per regolare la sensibilità dell'immagine. Utilizzare la manopola dell'oftalmoscopio per regolare con precisione la messa a fuoco.Quindi, premere il pulsante nero rotondo sul modulo di acquisizione per normalizzare l'immagine. Dopo la normalizzazione, fare clic sul pulsante ACQUIRE sul pannello touchscreen per salvare l'immagine. Passare al canale FA utilizzando il modulo di acquisizione e regolare sia la sensibilità che la messa a fuoco di ciascuna immagine come mostrato in precedenza per catturare la perdita della neovascolarizzazione coroideale o della lesione CNV.Quindi acquisire immagini per la fase iniziale di ICGA e FA tre o quattro minuti dopo l'iniezione. Una volta acquisite tutte le immagini necessarie, applicare un lubrificante o un unguento in gel sull'occhio del topo. La CNV capillare domina le lesioni della CNV nei topi giovani.Al contrario, i topi anziani mostrano CNV arteriolare, caratterizzata da vasi di grande calibro, anse vascolari e connessioni anastomotiche. Sia i topi giovani che quelli anziani mostrano una chiara visibilità della vascolarizzazione retinica in FA.In le immagini ICGA dei topi giovani, la vascolarizzazione retinica non è visibile e i vasi coroideali appaiono sbiaditi. Nelle immagini ICGA di topi anziani, si può osservare una vascolarizzazione retinica parziale mentre i vasi coroideali appaiono sbiaditi.La CNV arteriolare nei topi anziani mostra una dimensione maggiore della CNV e una perdita significativamente maggiore rispetto alla CNV capillare nei topi giovani.

Research

JoVE Journal

Medicine

Preparation of CNV Mouse Model for Indocyanine Green Angiography (IGCA) and Fluorescein Angiography (FA)

Characterization of Vascular Morphology of Neovascular Age-Related Macular Degeneration by Indocyanine Green Angiography

Age-related macular degeneration (AMD) is a leading cause of blindness among older individuals, and its prevalence is rapidly increasing due to the aging ...

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