preparation of cnv mouse model for indocyanine green angiography (igca) and fluorescein angiography (fa)

Karakterisering av forskjellige lesjonstyper av laserindusert CNV i mus

Age-related macular degeneration (AMD) is a prevalent condition that leads to severe vision loss in older individuals1. In the United States alone, the number of AMD patients is projected to double, reaching nearly 22 million by 2050, compared to the current 11 million. Globally, the estimated number of AMD cases is expected to reach a staggering 288 million by 20402.
Choroidal neovascularization (CNV), also known as &#34;wet&#34; or neovascular AMD, can have devastating effects on vision due to the formation of abnormal blood vessels beneath the central retina. This leads to hemorrhaging, retinal exudation, and significant vision loss. The introduction of anti-vascular endothelial growth factor (VEGF) therapies, which target extracellular VEGF, has revolutionized CNV treatment. However, despite these advancements, up to 50% of patients exhibit suboptimal responses to these therapies, with ongoing disease activity such as fluid accumulation and unresolved or new hemorrhages3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14.
Clinical studies have indicated that anti-VEGF resistance in CNV patients often corresponds to the presence of arteriolar CNV, characterized by large-caliber branching arterioles, vascular loops, and anastomotic connections9. Repeated anti-VEGF treatment can contribute to vessel abnormalization, the development of arteriolar CNV, and ultimately, resistance to anti-VEGF therapies14,15. In cases of arteriolar CNV, persistent fluid leakage is likely due to heightened exudation caused by inadequately formed tight junctions at arteriovenous anastomotic loops, particularly under conditions of high blood flow9. Conversely, individuals who respond well to anti-VEGF treatment tend to exhibit capillary CNV.
In our studies using animal models, we have demonstrated that laser-induced CNV in older mice develops arteriolar CNV and shows resistance to anti-VEGF treatment16,17. Conversely, laser-induced CNV in younger mice leads to the development of capillary CNV and high responsiveness to anti-VEGF treatment. Thus, it is crucial to differentiate between CNV vascular types for both mechanistic and therapeutic investigations.
In clinical settings, CNV is commonly classified based on fluorescein angiography (FA) leakage patterns (e.g., Type 1, Type 2), which use fluorescein dye to track exudation and identify areas of pathological leakage. In AMD research, CNV is predominantly studied using FA in animal models. However, FA fails to reveal the vascular morphology of CNV. Moreover, FA only captures images in the visible light spectrum and cannot visualize the choroidal vasculature beneath the retinal pigment epithelium (RPE). In contrast, indocyanine green (ICG), which exhibits strong affinity for plasma proteins, facilitates predominant intravascular retention and enables visualization of vascular structure and blood flow9. By utilizing the near-infrared fluorescence property of ICG, it becomes feasible to image the retinal and choroidal pigment using ICG angiography (ICGA). In this context, a protocol is presented that combines FA and ICGA to investigate the leakage and vascular morphology of laser-induced choroidal neovascularization (CNV) in young and old mice, where capillary and arteriolar CNV are observed.

Forfatter Spotlight: Overvinne anti-VEGF-resistens gjennom avansert vaskulær morfologivurdering ved koroidal neovaskularisering

Karakterisering av vaskulær morfologi av neovaskulær aldersrelatert makuladegenerasjon ved indocyanin grønn angiografi

We are working on the mechanism and treatment strategies of age-related macular degeneration, a prevalent condition causing severe vision loss in older individuals. Particularly, we're developing new treatments to tackle the issue of drug resistance to the current treatment of corneal neovascularization, which is the wet type of AMD. Our lab recently developed new treatment to ameliorate anti-VEGF resistance in CNV.This is achieved by using mouse CNV model. Our research has shown that old mice with laser-induced CNV develop arteriolar CNV, which is resistant to anti-VEGF treatment. In contrast, young mice with capillary CNV are responsive to the treatment.In AMD research, CNV is almost exclusively studied by fluorescein angiography to reveal leakage patterns in animal models. However, FA does not show CNV vascular morphology, and thus it is not suitable to study anti-VEGF resistance in AMD. The current FA method used for CNV imaging lacks vital information regarding the vascular morphology of CNV lesions, such as capillary or arteriolar CNV.However, by combining ICGA and FA, this protocol can evaluate both CNV leakage and vascular morphology. By assessing both leakage and CNV lesion morphology, it is possible to study the underlying molecule mechanism relating to arteriolar CNV, and therefore provide opportunities to find new targets to treat anti-VEGF resistance for AMD patients.

Fremstilling av CNV-musemodell for indocyanin grønn angiografi (IGCA) og fluoresceinangiografi (FA)

Etter å ha bedøvet musen, klem forsiktig en av musens poter for å sjekke om musen er tilstrekkelig bedøvet. Administrer 1% tropicamide oftalmiske oppløsningsdråper for å utvide musens øyne og vent i 30 sekunder. For å redusere øyebevegelse og blinking, bruk deretter 0,5% proparakainhydrokloriddråper på begge øynene, etterfulgt av smøremiddel øyegeldråper og plasser musen på en oppvarmingspute.Forbered en fargestoffblanding som inneholder et like stort volum indocyaningrønn, eller ICG, og fluoresceinfargestoff. Injiser 250 mikroliter av blandingen gjennom en intraperitoneal injeksjon i nedre venstre kvadrant nær musens bakben, plasser den parallelt med huden for å forhindre organperforering. Trekk stempelet forsiktig inn, slik at det ikke kommer blod inn i sprøytehetten.Fortsett ved å gradvis injisere fargestoffet i et jevnt tempo. Deretter plasserer du musen på varmeputen på bildeplattformen. Juster plasseringen av musens kropp i en 45 graders vinkel i forhold til kameraet, og vinkle hodet forsiktig litt nedover.Tørk forsiktig øyet som skal avbildes ved hjelp av en bomullspinne for å fjerne laget med smøremiddeldråper eller geler. Overfør kameraet mot musens øye og velg FA-kanalen fra innsamlingsmodulen. Ordne musens hode slik at optisk nerve er sentrert på skjermen, og unngå behovet for å vippe laserskanningens oftalmoskop.Bytt nå til ICGA-kanalen på anskaffelsesmodulen. Når øyet opptar hele skjermen på bildebehandlingsprogramvaren, roterer du den runde svarte knappen på innsamlingsmodulen for justering av bildefølsomhet. Bruk oftalmoskopets knapp for å finjustere fokuset.Deretter trykker du på den runde svarte knappen på oppkjøpsmodulen for å normalisere bildet. Etter normalisering klikker du på ERVERVE-knappen på berøringsskjermpanelet for å lagre bildet. Bytt til FA-kanalen ved hjelp av oppkjøpsmodulen og juster både følsomheten og fokuset til hvert bilde som vist tidligere for å fange lekkasjen av koroidal neovaskularisering eller CNV-lesjon.Ta deretter bilder for den tidlige fasen av ICGA og FA tre til fire minutter etter injeksjon. Når alle nødvendige bilder er tatt, bruk et gel smøremiddel eller salve til musens øye. Kapillær CNV dominerer CNV-lesjonene hos unge mus.I motsetning til dette utviser gamle mus arteriolar CNV, preget av store kaliberkar, vaskulære sløyfer og anastomotiske forbindelser. Både unge og gamle mus viser tydelig synlighet av retinal vaskulatur i FA.In ICGA-bildene av unge mus, er retinalvaskulaturen ikke synlig og koroidalkarene virker falmet. I ICGA-bildene av gamle mus kan delvis retinal vaskulatur observeres mens koroidalkarene ser falmet ut.Arteriolar CNV hos gamle mus viser en større CNV-størrelse og betydelig mer lekkasje sammenlignet med kapillær CNV hos unge mus.

Research

JoVE Journal

Medicine

Preparation of CNV Mouse Model for Indocyanine Green Angiography (IGCA) and Fluorescein Angiography (FA)

Characterization of Vascular Morphology of Neovascular Age-Related Macular Degeneration by Indocyanine Green Angiography

Age-related macular degeneration (AMD) is a leading cause of blindness among older individuals, and its prevalence is rapidly increasing due to the aging ...