preparation of cnv mouse model for indocyanine green angiography (igca) and fluorescein angiography (fa)

Caracterização de diferentes tipos de lesões de CNV induzida por laser em camundongos

Age-related macular degeneration (AMD) is a prevalent condition that leads to severe vision loss in older individuals1. In the United States alone, the number of AMD patients is projected to double, reaching nearly 22 million by 2050, compared to the current 11 million. Globally, the estimated number of AMD cases is expected to reach a staggering 288 million by 20402.
Choroidal neovascularization (CNV), also known as &#34;wet&#34; or neovascular AMD, can have devastating effects on vision due to the formation of abnormal blood vessels beneath the central retina. This leads to hemorrhaging, retinal exudation, and significant vision loss. The introduction of anti-vascular endothelial growth factor (VEGF) therapies, which target extracellular VEGF, has revolutionized CNV treatment. However, despite these advancements, up to 50% of patients exhibit suboptimal responses to these therapies, with ongoing disease activity such as fluid accumulation and unresolved or new hemorrhages3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14.
Clinical studies have indicated that anti-VEGF resistance in CNV patients often corresponds to the presence of arteriolar CNV, characterized by large-caliber branching arterioles, vascular loops, and anastomotic connections9. Repeated anti-VEGF treatment can contribute to vessel abnormalization, the development of arteriolar CNV, and ultimately, resistance to anti-VEGF therapies14,15. In cases of arteriolar CNV, persistent fluid leakage is likely due to heightened exudation caused by inadequately formed tight junctions at arteriovenous anastomotic loops, particularly under conditions of high blood flow9. Conversely, individuals who respond well to anti-VEGF treatment tend to exhibit capillary CNV.
In our studies using animal models, we have demonstrated that laser-induced CNV in older mice develops arteriolar CNV and shows resistance to anti-VEGF treatment16,17. Conversely, laser-induced CNV in younger mice leads to the development of capillary CNV and high responsiveness to anti-VEGF treatment. Thus, it is crucial to differentiate between CNV vascular types for both mechanistic and therapeutic investigations.
In clinical settings, CNV is commonly classified based on fluorescein angiography (FA) leakage patterns (e.g., Type 1, Type 2), which use fluorescein dye to track exudation and identify areas of pathological leakage. In AMD research, CNV is predominantly studied using FA in animal models. However, FA fails to reveal the vascular morphology of CNV. Moreover, FA only captures images in the visible light spectrum and cannot visualize the choroidal vasculature beneath the retinal pigment epithelium (RPE). In contrast, indocyanine green (ICG), which exhibits strong affinity for plasma proteins, facilitates predominant intravascular retention and enables visualization of vascular structure and blood flow9. By utilizing the near-infrared fluorescence property of ICG, it becomes feasible to image the retinal and choroidal pigment using ICG angiography (ICGA). In this context, a protocol is presented that combines FA and ICGA to investigate the leakage and vascular morphology of laser-induced choroidal neovascularization (CNV) in young and old mice, where capillary and arteriolar CNV are observed.

Autor em destaque: Superando a resistência anti-VEGF por meio da avaliação avançada da morfologia vascular na neovascularização coroidal

Caracterização da morfologia vascular da degeneração macular relacionada à idade neovascular pela angiografia com indocianina verde

We are working on the mechanism and treatment strategies of age-related macular degeneration, a prevalent condition causing severe vision loss in older individuals. Particularly, we're developing new treatments to tackle the issue of drug resistance to the current treatment of corneal neovascularization, which is the wet type of AMD. Our lab recently developed new treatment to ameliorate anti-VEGF resistance in CNV.This is achieved by using mouse CNV model. Our research has shown that old mice with laser-induced CNV develop arteriolar CNV, which is resistant to anti-VEGF treatment. In contrast, young mice with capillary CNV are responsive to the treatment.In AMD research, CNV is almost exclusively studied by fluorescein angiography to reveal leakage patterns in animal models. However, FA does not show CNV vascular morphology, and thus it is not suitable to study anti-VEGF resistance in AMD. The current FA method used for CNV imaging lacks vital information regarding the vascular morphology of CNV lesions, such as capillary or arteriolar CNV.However, by combining ICGA and FA, this protocol can evaluate both CNV leakage and vascular morphology. By assessing both leakage and CNV lesion morphology, it is possible to study the underlying molecule mechanism relating to arteriolar CNV, and therefore provide opportunities to find new targets to treat anti-VEGF resistance for AMD patients.

Preparação de Modelo de Camundongo CNV para Angiografia Verde com Indocianina (IGCA) e Angiografia com Fluoresceína (FA)

Depois de anestesiar o rato, aperte suavemente uma das patas do rato para verificar se o rato está adequadamente anestesiado. Administrar gotas de solução oftálmica de tropicamida a 1% para dilatar os olhos do rato e aguardar 30 segundos. Em seguida, para reduzir o movimento dos olhos e o piscar, aplique gotas de cloridrato de proparacaína a 0,5% em ambos os olhos, seguido de gotas de gel lubrificante para os olhos e posicione o mouse em uma almofada de água de aquecimento.Prepare uma mistura de corante contendo um volume igual de verde de indocianina ou ICG e corante fluoresceína. Injetar 250 microlitros da mistura através de uma injeção intraperitoneal no quadrante inferior esquerdo, perto das patas traseiras do rato, posicionando-o paralelo à pele para evitar a perfuração do órgão. Retraia cuidadosamente o êmbolo, certificando-se de que não entrou sangue na tampa da seringa.Prossiga injetando gradualmente o corante em um ritmo constante. Em seguida, coloque o mouse sobre a almofada de aquecimento da plataforma de imagem. Ajuste o posicionamento do corpo do mouse em um ângulo de 45 graus em relação à câmera e incline suavemente a cabeça ligeiramente para baixo.Limpe delicadamente o olho a ser fotografado usando um cotonete para remover a camada de colírios ou géis lubrificantes. Faça a transição da câmera para o olho do mouse e selecione o canal FA no módulo de aquisição. Organize a cabeça do mouse de forma que o nervo óptico fique centralizado na tela, evitando a necessidade de inclinar o oftalmoscópio de varredura a laser.Agora, mude para o canal ICGA no módulo de aquisição. Uma vez que o olho ocupe toda a tela no software de imagem, gire o botão preto redondo no módulo de aquisição para ajustes de sensibilidade da imagem. Use o botão do oftalmoscópio para ajustar o foco.Em seguida, pressione o botão preto redondo no módulo de aquisição para normalizar a imagem. Após a normalização, clique no botão ADQUIRIR no painel touchscreen para salvar a imagem. Alternar para o canal de AF usando o módulo de aquisição e ajustar a sensibilidade e o foco de cada imagem, como mostrado anteriormente, para capturar o vazamento da neovascularização de coroide ou lesão de CNV.Em seguida, capturar imagens para a fase inicial de ICGA e FA três a quatro minutos após a injeção. Uma vez que todas as imagens necessárias são capturadas, aplique um lubrificante gel ou pomada no olho do mouse. CNV capilar domina as lesões de CNV em camundongos jovens.Em contraste, camundongos velhos exibem CNV arteriolar, caracterizada por vasos de grande calibre, alças vasculares e conexões anastomóticas. Camundongos jovens e velhos mostram visibilidade clara da vasculatura retiniana em FA.In as imagens ICGA de camundongos jovens, a vasculatura retiniana não é visível e os vasos coroidais parecem desbotados. Nas imagens de ICGA de camundongos velhos, a vasculatura parcial da retina pode ser observada enquanto os vasos coroidais parecem desbotados.A CNV arteriolar em camundongos velhos exibe um tamanho maior de CNV e significativamente mais vazamento em comparação com CNV capilar em camundongos jovens.

Research

JoVE Journal

Medicine

Preparation of CNV Mouse Model for Indocyanine Green Angiography (IGCA) and Fluorescein Angiography (FA)

Characterization of Vascular Morphology of Neovascular Age-Related Macular Degeneration by Indocyanine Green Angiography

Age-related macular degeneration (AMD) is a leading cause of blindness among older individuals, and its prevalence is rapidly increasing due to the aging ...

Medicina