preparation of cnv mouse model for indocyanine green angiography (igca) and fluorescein angiography (fa)

Caracterización de diferentes tipos de lesiones de CNV inducidas por láser en ratón

Age-related macular degeneration (AMD) is a prevalent condition that leads to severe vision loss in older individuals1. In the United States alone, the number of AMD patients is projected to double, reaching nearly 22 million by 2050, compared to the current 11 million. Globally, the estimated number of AMD cases is expected to reach a staggering 288 million by 20402.
Choroidal neovascularization (CNV), also known as &#34;wet&#34; or neovascular AMD, can have devastating effects on vision due to the formation of abnormal blood vessels beneath the central retina. This leads to hemorrhaging, retinal exudation, and significant vision loss. The introduction of anti-vascular endothelial growth factor (VEGF) therapies, which target extracellular VEGF, has revolutionized CNV treatment. However, despite these advancements, up to 50% of patients exhibit suboptimal responses to these therapies, with ongoing disease activity such as fluid accumulation and unresolved or new hemorrhages3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14.
Clinical studies have indicated that anti-VEGF resistance in CNV patients often corresponds to the presence of arteriolar CNV, characterized by large-caliber branching arterioles, vascular loops, and anastomotic connections9. Repeated anti-VEGF treatment can contribute to vessel abnormalization, the development of arteriolar CNV, and ultimately, resistance to anti-VEGF therapies14,15. In cases of arteriolar CNV, persistent fluid leakage is likely due to heightened exudation caused by inadequately formed tight junctions at arteriovenous anastomotic loops, particularly under conditions of high blood flow9. Conversely, individuals who respond well to anti-VEGF treatment tend to exhibit capillary CNV.
In our studies using animal models, we have demonstrated that laser-induced CNV in older mice develops arteriolar CNV and shows resistance to anti-VEGF treatment16,17. Conversely, laser-induced CNV in younger mice leads to the development of capillary CNV and high responsiveness to anti-VEGF treatment. Thus, it is crucial to differentiate between CNV vascular types for both mechanistic and therapeutic investigations.
In clinical settings, CNV is commonly classified based on fluorescein angiography (FA) leakage patterns (e.g., Type 1, Type 2), which use fluorescein dye to track exudation and identify areas of pathological leakage. In AMD research, CNV is predominantly studied using FA in animal models. However, FA fails to reveal the vascular morphology of CNV. Moreover, FA only captures images in the visible light spectrum and cannot visualize the choroidal vasculature beneath the retinal pigment epithelium (RPE). In contrast, indocyanine green (ICG), which exhibits strong affinity for plasma proteins, facilitates predominant intravascular retention and enables visualization of vascular structure and blood flow9. By utilizing the near-infrared fluorescence property of ICG, it becomes feasible to image the retinal and choroidal pigment using ICG angiography (ICGA). In this context, a protocol is presented that combines FA and ICGA to investigate the leakage and vascular morphology of laser-induced choroidal neovascularization (CNV) in young and old mice, where capillary and arteriolar CNV are observed.

Autor destacado: Superación de la resistencia anti-VEGF a través de la evaluación avanzada de la morfología vascular en la neovascularización coroidea

Caracterización de la morfología vascular de la degeneración macular neovascular asociada a la edad mediante angiografía con verde de indocianina

We are working on the mechanism and treatment strategies of age-related macular degeneration, a prevalent condition causing severe vision loss in older individuals. Particularly, we're developing new treatments to tackle the issue of drug resistance to the current treatment of corneal neovascularization, which is the wet type of AMD. Our lab recently developed new treatment to ameliorate anti-VEGF resistance in CNV.This is achieved by using mouse CNV model. Our research has shown that old mice with laser-induced CNV develop arteriolar CNV, which is resistant to anti-VEGF treatment. In contrast, young mice with capillary CNV are responsive to the treatment.In AMD research, CNV is almost exclusively studied by fluorescein angiography to reveal leakage patterns in animal models. However, FA does not show CNV vascular morphology, and thus it is not suitable to study anti-VEGF resistance in AMD. The current FA method used for CNV imaging lacks vital information regarding the vascular morphology of CNV lesions, such as capillary or arteriolar CNV.However, by combining ICGA and FA, this protocol can evaluate both CNV leakage and vascular morphology. By assessing both leakage and CNV lesion morphology, it is possible to study the underlying molecule mechanism relating to arteriolar CNV, and therefore provide opportunities to find new targets to treat anti-VEGF resistance for AMD patients.

Preparación de un modelo de ratón de CNV para angiografía con verde de indocianina (IGCA) y angiografía con fluoresceína (FA)

Después de anestesiar al ratón, pellizque suavemente una de las patas del ratón para comprobar si el ratón está adecuadamente anestesiado. Administrar gotas de solución oftálmica de tropicamida al 1% para dilatar los ojos del ratón y esperar 30 segundos. Luego, para reducir el movimiento ocular y el parpadeo, aplique gotas de clorhidrato de proparacaína al 0,5% en ambos ojos, seguidas de gotas de gel lubricante para los ojos y coloque el mouse sobre una almohadilla de agua caliente.Prepare una mezcla de colorante que contenga un volumen igual de verde de indocianina, o ICG, y colorante de fluoresceína. Inyecte 250 microlitros de la mezcla a través de una inyección intraperitoneal en el cuadrante inferior izquierdo cerca de las patas traseras del ratón, colocándolo paralelo a la piel para evitar la perforación del órgano. Retraiga con cuidado el émbolo, asegurándose de que no haya sangre en la tapa de la jeringa.Proceda inyectando gradualmente el tinte a un ritmo constante. A continuación, coloque el mouse en la almohadilla térmica de la plataforma de imágenes. Ajuste la posición del cuerpo del ratón en un ángulo de 45 grados con respecto a la cámara e incline suavemente la cabeza ligeramente hacia abajo.Limpie delicadamente el ojo que se va a fotografiar con un hisopo de algodón para eliminar la capa de gotas o geles lubricantes para los ojos. Pase la cámara hacia el ojo del ratón y seleccione el canal FA en el módulo de adquisición. Coloque la cabeza del ratón de modo que el nervio óptico quede centrado en la pantalla, evitando la necesidad de inclinar el oftalmoscopio de barrido láser.Ahora, cambie al canal ICGA en el módulo de adquisición. Una vez que el ojo ocupe toda la pantalla en el software de imágenes, gire el botón negro redondo en el módulo de adquisición para ajustar la sensibilidad de la imagen. Utilice la perilla del oftalmoscopio para ajustar el enfoque.A continuación, presione el botón negro redondo en el módulo de adquisición para normalizar la imagen. Después de la normalización, haga clic en el botón ADQUIRIR en el panel de la pantalla táctil para guardar la imagen. Cambie al canal FA utilizando el módulo de adquisición y ajuste tanto la sensibilidad como el enfoque de cada imagen como se muestra anteriormente para capturar la fuga de la neovascularización coroidea o la lesión de NVC.A continuación, capture imágenes de la fase inicial de ICGA y FA tres o cuatro minutos después de la inyección. Una vez capturadas todas las imágenes necesarias, aplique un gel, lubricante o ungüento en el ojo del ratón. La NVC capilar domina las lesiones de NVC en ratones jóvenes.Por el contrario, los ratones viejos exhiben NVC arteriolar, caracterizada por vasos de gran calibre, asas vasculares y conexiones anastomóticas. Tanto los ratones jóvenes como los viejos muestran una clara visibilidad de la vasculatura de la retina en FA.In las imágenes de ICGA de ratones jóvenes, la vasculatura de la retina no es visible y los vasos coroideos aparecen difuminados. En las imágenes del ICGA de ratones viejos, se puede observar una vasculatura parcial de la retina mientras que los vasos coroideos aparecen descoloridos.La NVC arteriolar en ratones viejos exhibe un tamaño de CNV más grande y una fuga significativamente mayor en comparación con la NVC capilar en ratones jóvenes.

Research

JoVE Journal

Medicine

Preparation of CNV Mouse Model for Indocyanine Green Angiography (IGCA) and Fluorescein Angiography (FA)

Characterization of Vascular Morphology of Neovascular Age-Related Macular Degeneration by Indocyanine Green Angiography

Age-related macular degeneration (AMD) is a leading cause of blindness among older individuals, and its prevalence is rapidly increasing due to the aging ...

Investigación

Medicina