Para empezar, administrar analgesia por vía subcutánea a la rata anestesiada a la que previamente se le inyectó intracerebroventricularmente con el cóctel de liberación. Monta la rata en el marco estereotáxico. Asegure la cabeza con barras para los oídos, asegurándose de que el movimiento de rotación hacia adelante y hacia atrás no esté obstruido.
Estabilice la cabeza hacia abajo en un ángulo de 40 grados para extender correctamente la parte posterior del cuello. Afeitar el pelaje del cuello con una navaja de afeitar y desinfectar la piel con tres rondas alternas de povidona yodada al 10% y alcohol con hisopos de algodón estériles, frotando en diferentes direcciones durante tres a cinco segundos cada vez. Con la yema del dedo, identifique el área depresible de forma redonda entre la protuberancia occipital y la columna vertebral del atlas.
Marca este punto con un rotulador. Fije una jeringa de un mililitro al marco estereotáxico. Coloque la aguja para que entre en contacto con la piel en la marca.
Con unas pinzas, levante la piel mientras inserta la jeringa a través de las capas de piel. Tire suavemente del émbolo hacia atrás para crear una presión negativa dentro de la jeringa. Inserte gradualmente la aguja hasta que el líquido cefalorraquídeo sea visible en la jeringa.
Sostenga la aguja firmemente en esta posición y permita el flujo lento del líquido cefalorraquídeo. Retire lentamente el líquido cefalorraquídeo hasta 120 microlitros. Recupere con cuidado la jeringa.
Administrar un mililitro de suero normal por vía intraperitoneal para apoyar la reposición de líquidos del animal de experimentación. Combine la biopsia líquida con 400 microlitros de medio de células madre neurales y almacene el tubo de microcentrífuga a cuatro grados centígrados para su uso posterior. A continuación, traslade al animal a la zona de seguimiento postoperatorio.
Las biopsias de ordeño dieron como resultado cultivos de células madre neurales con un potencial de paso promedio de 3,17, alcanzando incluso nueve pasajes. Las células recolectadas se sembraron en pocillos recubiertos de poli-D-lisina, donde crecieron como monocapas adherentes y, más raramente, como neuroesferas. Las células recién aisladas que eran positivas para GFAP también eran inmunopositivas para el marcador quiescente ID3 y tenían la característica de morfología bipolar NSE.
La comparación inmunocitoquímica de las células derivadas de la biopsia y las derivadas de la autopsia mostró que el perfil de las células recolectadas era similar al de las células endógenas de la zona subependimaria. El factor de crecimiento dio lugar a un aumento concomitante y significativo de las células SOX2 y a una disminución de los neuroblastos positivos para doble cortina en ambas muestras.