Begynn med å sentrifugere den isolerte hjernecellesuspensjonen ved 300G i åtte minutter. Resuspender pelleten i 80 mikroliter HBSS med 0,5% BSA-løsning. Tilsett 20 mikroliter ikke-nevroncellebiotinantistoffcocktail og inkuber.
Vask cellene med to milliliter HBSS med 0,5% BSA. Deretter resuspenderer sentrifugepelleten i 80 mikroliter HBSS med 0,5% BSA. Tilsett nå 20 mikroliter antibiotinmikroperler og pipette for å blande grundig.
Etter kald inkubasjon tilsett 0,5 ml HBSS BSA-løsning. Sett opp stativet før du skyller kolonnen med 0,5 milliliter HBSS med 0,5 % BSA. Deretter legger du et 15 milliliter rør under kolonnen og passerer 0, 5 ml av cellesuspensjonen gjennom den.
Utfør tre vasker med 0,5 ml HBSS med 0,5% BSA-løsning for å fange gjenværende nevronceller. Fjern kolonnen fra magneten og plasser den inne i et nytt 15 milliliter rør. Legg til en milliliter HBSS med 0,5% BSA og bruk stempelet til å samle magnetisk merkede ikke-nevrale celler.
Etter cellesentrifugering, resuspender cellene i en milliliter HBSS med 0,5% BSA-løsning. Tell cellene på et neubauer tellekammer under et lysfeltmikroskop. LepR-positive nevroner begynte å danne nevritter etter 48 timer.
Ved DIV4 viste aksonale utvidelser fremgang mens dendrittiske prosesser begynte å vises. Ved DIV6 var nevronene tilstrekkelig utviklet. Immunfluorescerende studier viste at ingen gliaceller eller andre ikke-nevrale celler ble observert.
Cellens nevrale natur ble bekreftet av mikrotubuliassosiert protein to-farging. Ved DIV10 uttrykte 30 % av LepR-positive celler POMC. Synaptisk tilkobling og funksjonalitet ble observert i generelle kulturer som inneholder heterogene hypotalamiske nevronpopulasjoner.
