Name: Surgical Protocol for the Selective Photoconversion of Lung Metastases
Uploaded: 2023-07-07T14:40:00
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surgical protocol for the selective photoconversion of lung metastases

Untersuchung der Ausbreitung von Tumorzellen aus Lungenmetastasen

Metastasis is the leading cause of cancer-related deaths1.&#160;Metastatic cancer arises when cells from the primary tumor disseminate throughout the body and proliferate into clinically detectable tumors in distant organs2,3.
Although metastasis is commonly thought of as a unidirectional process wherein tumor cells disseminate from the primary tumor and colonize distant organs4, increasing clinical and experimental evidence suggests that a more complex, multi-directional process is at play. It has been shown that circulating tumor cells can reseed the primary tumor (if still in place)5,6,7,8,9, and tumor cells from existing metastatic foci can travel to tertiary sites and give rise to new lesions10,11,12,13. Indeed, evidence from recent genomic analyses suggests that some metastatic lesions arise not from the primary tumor, but from other metastases-a phenomenon known as &#34;metastasis-from-metastases&#34; or &#34;metastasis-to-metastasis seeding&#34;14,15,16. Metastasis-to-metastasis seeding can perpetuate the disease process even after removal of the primary tumor, increasing metastatic burden, and decreasing patient quality of life and survival. Therefore, understanding the processes behind metastasis-to-metastasis seeding is crucial to refining treatment strategies for patients with metastatic disease.
Despite the potentially severe clinical implications, little is known about metastasis-to-metastasis seeding, due in part to logistical and technological limitations. Human studies are limited by a paucity of clinical samples. Clinical resection and biopsy of metastatic lesions are uncommon, as is the biopsy of seemingly healthy organs, where single disseminated tumor cells may lurk. This means that human studies are typically only possible using autopsy samples from individuals whose primary tumors are either still in place or were previously resected but are still available to researchers. When such samples are available, lineage analyses of cancer progression must be performed using sequencing methods14. However, bulk sequencing of matched primary tumors and metastases does not have the sensitivity needed for comprehensive lineage tracing. For instance, bulk sequencing of one lesion may reveal a subclone that is undetectable in any of its matched lesions. In this case, one would be unable to determine the origin of this subclone. It may have been present in the primary tumor or another metastasis at a frequency below the limit of detection, or it may have arisen after the initial colonization of the metastatic lesion it was found in. Single-cell sequencing provides increased sensitivity, but its high cost limits the large-scale application of this technique. The retrospective nature of these studies also means that they provide limited insight into transient metastatic events and the disease landscape at different time points.
In animal models, recent technological advances now allow for prospective phylogenetic mapping with high spatial and temporal resolution17,18,19,20. These techniques utilize CRISPR/Cas9 genome editing to engineer cells with an evolving barcode - heritable mutations that accumulate over time. Upon sequencing, the lineage of each cell can be traced based on the mutational profile of its barcode17,18,19,20. Indeed, such technology is already being used to map metastasis-to-metastasis seeding. In a recent paper, Zhang et al. demonstrated that breast and prostate cancer cells in bone metastases redisseminate from the bone to seed secondary metastases in multiple organs21.
While these novel methods have great potential to generate detailed, high-resolution phylogenetic maps of cancer progression, they are highly impractical for those studying the exact timing of metastasis-to-metastasis seeding events and what promotes or prevents them. Filling these knowledge gaps is crucial to refining our understanding and treatment of metastatic cancer, but there is a noticeable lack of technologies to facilitate such studies. To address this need, we recently developed - and present herein - a novel technique that allows us to specifically mark tumor cells via photoconversion in a metastatic site (the lung) and subsequently reidentify them in tertiary organs. Using this technique, we recently showed that breast cancer cells do redisseminate from lung metastases and seed tertiary organs13. This technique may also be used to determine the timing of redissemination events within a narrow window and quantify redisseminated tumor cells, facilitating the study of organotropism of redisseminated cells and what promotes/prevents redissemination.
While photoconversion and locally inducible cre/lox systems that permanently replace one fluorescent protein with another have been previously used to mark and track tumor cells11,22,23, to our knowledge, no approach for spatiotemporal marking of tumor cells has been optimized to target the lung - one of the most common sites of metastasis among men and women diagnosed with any of the 14 most common cancers24. Any cancer cell type and any protocol for lung metastasis generation may be used with our procedure, making it broadly useful for metastasis researchers. All cancer cells used to generate lung metastases should express a photoconvertible or photo-switchable protein, and researchers may choose which protein to use based on their specific needs and resources. In this study, we used 6DT1 breast cancer cells that stably expressed the photoconvertible green-to-red fluorescent protein Dendra2 (6DT1-Dendra2 cells)25 tagged to the histone H2B. We injected 5.0 &#215; 104 6DT1-Dendra2 cells into the fourth mammary fat pad of female Rag2-/- mice. Primary tumors were palpable between 12 and 16 days after injection and were not resected for the duration of the experiment. Spontaneous lung metastases developed between 19 and 26 days after tumor cell injection. Photoconversion surgeries were performed between 26 and 29 days after tumor cell injection. Mice were sacrificed by 72 h post surgery due to lung metastasis burden.

Autor im Rampenlicht: Entschlüsselung der Metastasen-zu-Metastasen-Seeding mit einer neuen In-vivo-Technik zur Verfolgung der Ausbreitung von Brustkrebs 

Verfolgung der Ausbreitung von Tumorzellen aus Lungenmetastasen mittels Photokonversion

Recent evidence suggests that existing metastatic lesions can act as a source of disseminating tumor cells that give rise to new lesions. This process is called metastasis to metastasis seeding and can increase tumor burden and decrease the quality of life and survival of cancer patients. Our method was developed to study metastasis to metastasis seeding and the factors that influence it.This technique has helped our lab establish that breast cancer cells can spread from lung metastases and enabled us to investigate factors that promote or prevent metastasis. These findings may guide future research on slowing the progression of metastatic cancer. The lungs are a common site of metastasis, but very few techniques allow for the study of tumor cell dynamics in vivo.This technique enables the tracking of tumor cells in live mice facilitating the study of lung metastasis specific dissemination pathways and therapies. Metastatic cancer is often an incurable and fatal disease. This technique can be used to study ways to reduce its spread leading to therapies that extend the lives of patients.

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Surgical Protocol for the Selective Photoconversion of Lung Metastases  

Operationsprotokoll zur selektiven Photokonversion von Lungenmetastasen

Nachdem Sie die Maus für die Operation vorbereitet haben, identifizieren Sie den Zielbereich, sieben Millimeter links vom Brustbein und etwa sieben Millimeter oberhalb des Subkostalrandes. Heben Sie die Haut mit einer Pinzette über den identifizierten Bereich und machen Sie einen 10 Millimeter langen kreisförmigen Schnitt mit einer scharfen Mikropräparierschere, um nur die Haut zu schneiden. Entfernen Sie dann das Weichgewebe über dem Brustkorb und verätzen Sie alle wichtigen Blutgefäße an beiden Enden mit einem Kauterstift.Heben Sie die sechste oder siebte Rippe mit einer Pinzette an und stechen Sie mit einer einzigen Klinge der stumpfen Mikropräparierschere in den Zwischenrippenmuskel. Drehen Sie nun vorsichtig die Schere und machen Sie einen etwa 10 Millimeter langen Schnitt im Zwischenrippenraum, wobei Sie den Kontakt mit dem Lungengewebe und den Rippen vermeiden. Lassen Sie Druckluft am Handgelenk oder an der Hand vorsichtig ab, um die geeignete Strömungsstärke zu bestimmen und die Düse von Schmutz zu befreien.Tragen Sie dann kurze Luftstöße auf den Einschnitt auf, um eine Lungenverletzung zu vermeiden. Heben Sie mit der Zange die sechste oder siebte Rippe an und führen Sie den Retraktor mit Klingen parallel zur Brustwand in den Interkostalschnitt ein. Lassen Sie dann den Griff vorsichtig los, damit sich der Retraktor öffnen und die Lunge allmählich freilegen kann.Tragen Sie nun zwei bis drei Tropfen steriles, auf 37 Grad erwärmtes PBS auf das freiliegende Lungengewebe auf, um ein Austrocknen zu verhindern. Lege ein Stück Aluminiumfolie mit einem kleinen Ausschnitt über die Maus und positioniere sie direkt über dem freiliegenden Lungengewebe. Stellen Sie sicher, dass der Ausschnitt nur den offenen Thorax und das nahe gelegene Gewebe zeigt, um eine gezielte Lungenfotoumwandlung zu ermöglichen.Positionieren Sie als Nächstes eine Schachtel mit einem Ausschnitt über der Maus und der Aluminiumfolie und stellen Sie sicher, dass der Ausschnitt mit der freiliegenden Lunge ausgerichtet ist. Und stellen Sie die Fotokonvertierungslampe direkt über den Ausschnitt an der Box. Aktivieren Sie dann die Fotokonversionslampe, um das freigelegte Lungengewebe für eine ununterbrochene Zeitspanne von sechs Minuten zu beleuchten.Deaktivieren Sie nach der Fotokonvertierung die Lampe und entfernen Sie den Lampenkasten und die Alufolienmaske von der Maus. Trennen Sie die Lunge von der Brustwand, indem Sie Luft am Handgelenk und dann Luft am Brustschnitt ablassen. Fassen Sie den Griff des Retraktors fest und drücken Sie ihn, um die Klingen zu schließen.Manövrieren Sie den geschlossenen Retraktor vorsichtig aus dem Zwischenrippenraum und achten Sie darauf, dass er nicht mit dem Lungengewebe in Berührung kommt. Verwenden Sie dann die 5-0-Seidennaht, um den Interkostalschnitt mit einem einfachen kontinuierlichen Nahtmuster zu verschließen, wobei sichergestellt wird, dass die Rippe auf beiden Seiten des Schnitts eingearbeitet wird. Ziehen Sie die Naht fest, um sicherzustellen, dass die Wundränder ausgerichtet sind und die Integrität der Brustwand wiederhergestellt wird.Befestigen Sie die Naht, indem Sie das Ende viermal verknoten. Kürzen Sie die Nahtschwänze so nah wie möglich am Knoten und verschließen Sie die Haut mit chirurgischen Klammern. Um überschüssige Luft aus der Brusthöhle zu entfernen, führen Sie eine Ein-Milliliter-Spritze mit einer 28-Gauge-Nadel unter den Xiphoid-Prozess ein.Ziehen Sie die Spritze auf etwa einen Milliliter zurück. Nehmen Sie die Spritze aus der Maus und lassen Sie die Luft ab. Es werden Bilder von exponiertem Dendra2 gezeigt, das Lungenmetastasen vor der Blaulicht-Exposition exprimiert.Die Exposition von Dendra2, das Lungenmetastasen exprimiert, bei blauem Licht zeigte, dass eine sechsminütige Exposition sowohl in ex vivo als auch in vivo Proben das hellste Signal im photokonvertierten Kanal erzeugte. Fotokonvertierte und nicht-fotokonvertierte Zellen wurden in allen drei Gewebetypen von Mäusen identifiziert, die sich einer Operation mit blauem Licht unterzogen hatten. In den Geweben von Mäusen, die ohne Blaulicht-Exposition operiert wurden, wurden nur nicht-photokonvertierte Tumorzellen gefunden.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Surgical Protocol for the Selective Photoconversion of Lung Metastases

Tracking Tumor Cell Dissemination from Lung Metastases Using Photoconversion

Metastasis - the systemic spread of cancer - is the leading cause of cancer-related deaths. Although metastasis is commonly thought of as a unidirectional ...