Name: Bereiding van kippenlens voor micro-injectie van een RCAS(A)-retrovirus
Uploaded: 2023-09-01T14:05:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Preparation of Chicken Lens for Microinjection of an RCASA Retrovirus at JoVE.com

preparation of chicken lens for microinjection of an rcas(a) retrovirus

Het bestuderen van eiwitexpressie tijdens de ontwikkeling van kippenlenzen

The goal of this protocol is to describe the methodology of embryonic chicken lens microinjection of an RCAS(A) (replication-competent avian sarcoma/leukosis retrovirus A). Effective retroviral delivery in an embryonic chicken lens has been demonstrated to be a promising tool for the in vivo study of the molecular mechanism and structure-function of lens proteins in normal lens physiology, pathological conditions, and development. Moreover, this experimental model could be used for the identification of therapeutic targets and drug screening for conditions such as human congenital cataracts. In all, this protocol aims to lay out the necessary steps for the development of a customizable platform for the study of lens proteins.
Embryonic chicks (Gallus domesticus), owing to their similarity in lens structure and function with the human lens, are a well-established animal model for the study of lens development and physiology1,2,3,4. The use of an RCAS(A) replication-competent avian retrovirus has been regarded as a highly effective, rapid, and customizable system to express exogenous proteins in chick embryos. Notably, it has a unique ability to confine the target gene transfer to proliferative lens fiber cells without the need for tissue-specific promoters, using the unique embryonic development time frame in which the presence of empty lens lumen permits in situ RCAS(A) microinjection into the restricted site for the expression of exogenous proteins within proliferative lens fiber cells5,6,7,8.
The chick embryo microinjection procedure, described in-depth here, is based originally partially on the work of Fekete et. al.6 and further developed by Jiang et. al.8 and has been utilized as a means of introducing both viral and nonviral plasmids into the lens of embryonic chicks1,9,10,11,12,13. Overall, the previous work demonstrates the potential of utilizing this methodology to study lens development, differentiation, cellular communication, and disease progression, and for the discovery and testing of therapeutic targets for lens pathological conditions such as cataracts.

Auteur in de schijnwerpers: onderzoek naar lensontwikkeling en -functie door middel van micro-injectie van RCAS(A)-retrovirus in embryonale kippenlens 

Micro-injectie van recombinant RCAS(A)-retrovirus in embryonale kippenlens

The presented methodology of embryonic chicken lens microinjection of a RCAS retrovirus is meant as a tool for studying in situ function and expression of proteins during lens development. Compared to other approaches, such as transgenic models and ex vivo cultures, the RCAS replication-competent avian retrovirus provides a highly-effective, rapid, and customizable system for expressing exogenous proteins in chick embryos. Targeted gene transfer can be confined to proliferative lens fiber cells without the need for promoters.There is prominent potential for utilizing this methodology to study lens development, differentiation, cellular communication, and disease progression, and for the discovery and testing of therapeutic targets for lens pathological conditions such as cataracts.

Watch this Scientific Journal Video about Preparation of Chicken Lens for Microinjection of an RCASA Retrovirus at JoVE.com

Bereiding van kippenlens voor micro-injectie van een RCAS(A)-retrovirus

Bevestig om te beginnen het capillair van borosilicaatglas aan de met rubber beklede clips in de handmatige verticale micropipettrekker. Stel de warmtetemperatuur van de micropipettrekker in op 950 graden Celsius en voer pre-pulling uit om een dunner en zachter glazen capillair te verkrijgen. Stel vervolgens de warmtetemperatuur in op 790 graden Celsius en voer een secundaire trek uit om de uiteindelijke micropipetten te produceren.Gebruik een micropipetmolen om de puntopening voorzichtig te slijpen tot een buitendiameter van 11 micrometer. Plaats de micropipetten vervolgens in een sponsklemmen in een glazen pot. Broed de bevruchte kippeneieren uit tot ontwikkelingsstadium 18 in een bevochtigde schommelbroedmachine van 37 graden Celsius.Veeg het werkgebied grondig af met 70% ethanol. Haal de eieren na ontwikkeling uit de broedmachine. Besproei de eieren met 70% ethanol en laat ze aan de lucht drogen.Leg het ei vervolgens op een eierhouder met het grotere uiteinde naar boven gericht. Tik met een scherpe tang voorzichtig op het grotere uiteinde van de eierschaal om een gat met een diameter van twee centimeter te maken. Verwijder vervolgens de fragmenten van de eierschaal.Plaats het ei op een ontleedmicroscooptafel en lokaliseer het embryo. Gebruik vervolgens de fijne ontleedtang en schaar om het vruchtwater af te knippen dat de bovenkant van het embryo bedekt. Plaats vervolgens een petrischaaltje van 60 millimeter over de opening van het ei.

Research

JoVE Journal

Biology

Preparation of Chicken Lens for Microinjection of an RCAS(A) Retrovirus

Microinjection of Recombinant RCAS(A) Retrovirus into Embryonic Chicken Lens

Embryonic chicken (Gallus domesticus) is a well-established animal model for the study of lens development and physiology, given its high degree of ...