Name: Preparazione della lente di pollo per la microiniezione di un retrovirus RCAS(A)
Uploaded: 2023-09-01T14:05:00
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preparation of chicken lens for microinjection of an rcas(a) retrovirus

Studiare l'espressione proteica durante lo sviluppo del cristallino di pollo

The goal of this protocol is to describe the methodology of embryonic chicken lens microinjection of an RCAS(A) (replication-competent avian sarcoma/leukosis retrovirus A). Effective retroviral delivery in an embryonic chicken lens has been demonstrated to be a promising tool for the in vivo study of the molecular mechanism and structure-function of lens proteins in normal lens physiology, pathological conditions, and development. Moreover, this experimental model could be used for the identification of therapeutic targets and drug screening for conditions such as human congenital cataracts. In all, this protocol aims to lay out the necessary steps for the development of a customizable platform for the study of lens proteins.
Embryonic chicks (Gallus domesticus), owing to their similarity in lens structure and function with the human lens, are a well-established animal model for the study of lens development and physiology1,2,3,4. The use of an RCAS(A) replication-competent avian retrovirus has been regarded as a highly effective, rapid, and customizable system to express exogenous proteins in chick embryos. Notably, it has a unique ability to confine the target gene transfer to proliferative lens fiber cells without the need for tissue-specific promoters, using the unique embryonic development time frame in which the presence of empty lens lumen permits in situ RCAS(A) microinjection into the restricted site for the expression of exogenous proteins within proliferative lens fiber cells5,6,7,8.
The chick embryo microinjection procedure, described in-depth here, is based originally partially on the work of Fekete et. al.6 and further developed by Jiang et. al.8 and has been utilized as a means of introducing both viral and nonviral plasmids into the lens of embryonic chicks1,9,10,11,12,13. Overall, the previous work demonstrates the potential of utilizing this methodology to study lens development, differentiation, cellular communication, and disease progression, and for the discovery and testing of therapeutic targets for lens pathological conditions such as cataracts.

Autore in primo piano: Studio dello sviluppo e della funzione del cristallino attraverso la microiniezione di retrovirus RCAS(A) nel cristallino embrionale di pollo 

Microiniezione di retrovirus RCAS(A) ricombinante nel cristallino embrionale di pollo

The presented methodology of embryonic chicken lens microinjection of a RCAS retrovirus is meant as a tool for studying in situ function and expression of proteins during lens development. Compared to other approaches, such as transgenic models and ex vivo cultures, the RCAS replication-competent avian retrovirus provides a highly-effective, rapid, and customizable system for expressing exogenous proteins in chick embryos. Targeted gene transfer can be confined to proliferative lens fiber cells without the need for promoters.There is prominent potential for utilizing this methodology to study lens development, differentiation, cellular communication, and disease progression, and for the discovery and testing of therapeutic targets for lens pathological conditions such as cataracts.

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Preparazione della lente di pollo per la microiniezione di un retrovirus RCAS(A)

Per iniziare, fissare il capillare in vetro borosilicato alle clip imbottite in gomma nell'estrattore verticale manuale per micropipette. Impostare la temperatura di calore dell'estrattore per micropipette a 950 gradi Celsius ed eseguire il pre-pull per ottenere un capillare di vetro più sottile e morbido. Quindi impostare la temperatura del calore a 790 gradi Celsius ed eseguire un pull secondario per produrre le micropipette finali.Utilizzando un macinino per micropipette, affilare con cura l'apertura del puntale fino a un diametro esterno di 11 micrometri. Quindi posizionare le micropipette in un tampone di serraggio di spugna all'interno di un barattolo di vetro. Incubare le uova di gallina fecondate fino allo stadio di sviluppo 18 in un'incubatrice a dondolo umidificata a 37 gradi Celsius.Pulire accuratamente l'area di lavoro con etanolo al 70%. Dopo lo sviluppo, rimuovere le uova dall'incubatrice. Spruzzare le uova con etanolo al 70% e lasciarle asciugare all'aria.Quindi posiziona l'uovo su un portauova con l'estremità più grande rivolta verso l'alto. Usando un paio di pinze dentate affilate, picchiettare con cautela l'estremità più grande del guscio d'uovo per creare un foro di due centimetri di diametro. Quindi rimuovere i frammenti del guscio dell'uovo.Posizionare l'ovulo su un tavolino da microscopio da dissezione e localizzare l'embrione. Successivamente, usa le pinze e le forbici da dissezione fine per tagliare la membrana amniotica che copre la parte superiore dell'embrione. Quindi posizionare una capsula di Petri da 60 millimetri sopra l'apertura dell'uovo.

Research

JoVE Journal

Biology

Preparation of Chicken Lens for Microinjection of an RCAS(A) Retrovirus

Microinjection of Recombinant RCAS(A) Retrovirus into Embryonic Chicken Lens

Embryonic chicken (Gallus domesticus) is a well-established animal model for the study of lens development and physiology, given its high degree of ...