Name: Microinjection of an RCAS(A) Retrovirus into Embryonic Chicken Lens for Expressing Exogenous Proteins
Uploaded: 2023-09-01T14:05:00
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microinjection of an rcas(a) retrovirus into embryonic chicken lens for expressing exogenous proteins 

닭 수정체 발달 중 단백질 발현 연구

The goal of this protocol is to describe the methodology of embryonic chicken lens microinjection of an RCAS(A) (replication-competent avian sarcoma/leukosis retrovirus A). Effective retroviral delivery in an embryonic chicken lens has been demonstrated to be a promising tool for the in vivo study of the molecular mechanism and structure-function of lens proteins in normal lens physiology, pathological conditions, and development. Moreover, this experimental model could be used for the identification of therapeutic targets and drug screening for conditions such as human congenital cataracts. In all, this protocol aims to lay out the necessary steps for the development of a customizable platform for the study of lens proteins.
Embryonic chicks (Gallus domesticus), owing to their similarity in lens structure and function with the human lens, are a well-established animal model for the study of lens development and physiology1,2,3,4. The use of an RCAS(A) replication-competent avian retrovirus has been regarded as a highly effective, rapid, and customizable system to express exogenous proteins in chick embryos. Notably, it has a unique ability to confine the target gene transfer to proliferative lens fiber cells without the need for tissue-specific promoters, using the unique embryonic development time frame in which the presence of empty lens lumen permits in situ RCAS(A) microinjection into the restricted site for the expression of exogenous proteins within proliferative lens fiber cells5,6,7,8.
The chick embryo microinjection procedure, described in-depth here, is based originally partially on the work of Fekete et. al.6 and further developed by Jiang et. al.8 and has been utilized as a means of introducing both viral and nonviral plasmids into the lens of embryonic chicks1,9,10,11,12,13. Overall, the previous work demonstrates the potential of utilizing this methodology to study lens development, differentiation, cellular communication, and disease progression, and for the discovery and testing of therapeutic targets for lens pathological conditions such as cataracts.

저자 스포트라이트: Investigating Lens Development and Function Through Microinjection of RCAS(A) Retrovirus in Embryonic Chicken Lens(배아 닭 수정체에서 RCAS(A) 레트로바이러스의 미세주입을 통한 렌즈 발달 및 기능 조사) 

재조합 RCAS(A) 레트로바이러스를 배아 닭 수정체에 미세주입

The presented methodology of embryonic chicken lens microinjection of a RCAS retrovirus is meant as a tool for studying in situ function and expression of proteins during lens development. Compared to other approaches, such as transgenic models and ex vivo cultures, the RCAS replication-competent avian retrovirus provides a highly-effective, rapid, and customizable system for expressing exogenous proteins in chick embryos. Targeted gene transfer can be confined to proliferative lens fiber cells without the need for promoters.There is prominent potential for utilizing this methodology to study lens development, differentiation, cellular communication, and disease progression, and for the discovery and testing of therapeutic targets for lens pathological conditions such as cataracts.

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Microinjection of an RCAS(A) Retrovirus into Embryonic Chicken Lens for Expressing Exogenous Proteins   

외인성 단백질을 발현하기 위해 배아 닭 수정체에 RCAS(A) 레트로바이러스를 미세주입 

시작하려면 RCAS(A)레트로바이러스 스톡을 얼음 위에서 해동합니다. micropipette를 막는 것을 피하기 위하여는, 10에 해결책, 4 섭씨 온도에 10 초 동안 000 G에 분리하고 얼음에 해결책을 지키고 있는 동안 새로운 관으로 상청액을 옮기십시오. 늘어난 실험실 파라필름을 35 x 10mm 세포 배양 접시에 놓고 파라필름에 1마이크로리터의 멸균 PBS를 추가합니다.준비된 유리 마이크로피펫을 자동 Pico 인젝터에 연결합니다. 충전 모드를 눌러 PBS를 마이크로피펫에 채운 다음 주입 모드를 눌러 할당된 1마이크로리터의 액체를 테스트합니다. 늘어난 실험실 파라필름의 두 번째 조각을 새 세포 배양 접시에 놓고 1마이크로리터의 빠른 녹색 염색 바이러스 스톡을 필름에 추가합니다.마이크로피펫의 끝을 바이러스 스톡으로 내리고 충전 모드를 눌러 마이크로피펫에 1마이크로리터의 바이러스 스톡을 채웁니다. 해부 현미경 아래에서 자동 주입기에 연결된 채워진 마이크로피펫을 닭 배아 수정체의 대상 영역으로 내립니다. 그런 다음 광원을 조정하여 렌즈 소포를 선명하게 볼 수 있도록 합니다.마이크로피펫이 렌즈 루멘 내부의 올바른 위치에 있는지 확인한 후 5-40나노리터의 바이러스 스톡을 주입합니다. 주입 후 45초 동안 기다렸다가 마이크로피펫을 조심스럽게 제거합니다. 다음으로, 렌즈의 빈 루멘에서 누출 없이 빠른 녹색 염료를 검사하여 미세 주입이 성공했는지 확인합니다.검사 후 달걀 껍질 입구를 스카치 테이프로 밀봉하고 달걀을 섭씨 37도의 가습 정적 인큐베이터에 넣습니다. 이 연구는 면역형광을 통한 키메라 커넥손 50 및 43 루프의 조직학적 평가를 보여줍니다. Anti-Flag 라벨링을 사용하여 외인성 커넥슨을 내인성 커넥슨과 구별했습니다.이 연구는 또한 커넥슨 50의 세포 내 루프 도메인과 아쿠아포린 제로 사이의 상호 작용을 평가합니다.

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Biology

Microinjection of an RCAS(A) Retrovirus into Embryonic Chicken Lens for Expressing Exogenous Proteins 

Microinjection of Recombinant RCAS(A) Retrovirus into Embryonic Chicken Lens

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