Name: Modèle microfluidique d’entérocolite nécrosante sur puce pour l’étude de la physiopathologie de la NEC
Uploaded: 2023-07-28T12:10:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Microfluidic Necrotizing Enterocolitis-on-a-Chip Model for Studying NEC Pathophysiology at JoVE.com

microfluidic necrotizing enterocolitis-on-a-chip model for studying nec pathophysiology

Un modèle d’entérocolite nécrosante pour les études mécanistes et la découverte de médicaments

Necrotizing enterocolitis (NEC) affects preterm infants, with an incidence of up to 10% in those born weighing &#60; 1500 g1. The pathophysiology of NEC is complex and includes damage to the intestinal epithelium, disruption of intestinal tight junctions, increased gut barrier permeability, immune dysregulation, and epithelial cell death2,3. Our understanding of the mechanisms involved in the pathogenesis of NEC remains incomplete, and despite decades of research, there are still no effective targeted therapies.
A significant barrier to advancing NEC research is the limited availability and small size of primary intestinal tissue isolated from human infants. Intestinal tissue resected from infants with NEC is often necrotic and severely damaged, which complicates studies into mechanisms that precede disease onset. For example, the small intestine of infants with NEC is inundated with immune cells, and a reduced number of intestinal stem cells, decreased epithelial cell proliferation, and increased epithelial cell apoptosis are also observed4,5,6,7. This leads to difficulties in culturing intestinal epithelial cells from these samples and in isolating RNA and proteins, which can be degraded in this hostile inflammatory environment. Additionally, since the disease process is already advanced in infants with surgical NEC, mechanistic studies into factors that induce disease are unfeasible. These limitations have led to a reliance on animal models for mechanistic studies of NEC.
Animal models of NEC have been established for mice, rats, piglets, rabbits, and baboons5,8,9,11. A strength of animal&#160;models is that NEC-like intestinal disease is induced by factors associated with NEC onset in humans, including a dysbiotic microbiome, repeated episodes of hypoxia, and the absence of breast milk feeds5,8,10,11. In addition, the inflammatory response and pathologic changes observed during experimental NEC parallel human disease5,9,12. While these models mimic many of the features of human NEC, there are inherent differences between the pathophysiology of NEC in animals and humans. For example, the murine model of NEC is induced in mice born full-term, and although their intestinal development is incomplete, the pathophysiology of NEC is inherently different in this clinical context. Murine intestinal gene expression at birth is similar to a pre-viable human fetus and does not approximate that of a preterm neonate of 22-24 weeks gestation until day 14 (P14)13. This confounds the murine NEC model because intestinal injury cannot generally be induced in mice after P10. In addition, inbred strains of mice lack the immunologic14 and microbiologic diversity of human neonates15, which serves as another confounding factor. Thus, increased incorporation of primary human samples into NEC research improves the clinical relevance of studies in this field.
Studies into the mechanisms of NEC in vitro have traditionally utilized monotypic cell lines derived from adult intestinal cancer cells, such as colorectal adenocarcinoma (Caco2) and human colon adenocarcinoma (HT-29) cells16. These models are convenient but limited in physiologic relevance due to their growth from adult cancer cells, non-polarized architecture, and phenotypic changes related to repeated passages in culture. Intestinal enteroids improve upon those models since they can be grown from the crypts of intestinal tissue, differentiated into all intestinal epithelial subtypes, and form a three-dimensional (3D) villus-like structure17,18,19,20. Recently, intestinal enteroids have been combined with microfluidic technology to develop a small intestine-on-a-chip model and provide a more physiologically relevant in vitro model system21.
The initial organ-on-a-chip microfluidic devices were introduced in the early 2000s22,23,24. The first organ-on-a-chip model was the human breathing lung-on-a-chip25. This was followed by numerous single-organ models such as intestine21, liver26, kidneys27, bone marrow28, blood-brain barrier29, and heart30. These organ-on-a-chip models have been used to study acute, chronic, and rare diseases, including acute radiation syndrome,31 chronic obstructive pulmonary disease,32 and neurodegenerative diseases33. The polarized nature of the cells on these chips and the presence of two cellular compartments separated by a porous membrane allows for the modeling of complex physiologic processes such as perfusion, chemical concentration gradients, and immune cell chemotaxis34,35. These microfluidic systems thus provide a new tool for studying the pathophysiology and mechanisms of human disease.
The small intestine-on-a-chip model was described by Kasendra et al. in 2018, who utilized pediatric (ages 10-14 years old) small intestinal biopsy specimens differentiated into enteroids and cultured on a microfluidic device21. Vascular endothelial cells, continuous media flow, and stretch/relaxation were also incorporated into this model. They observed intestinal epithelial subtype differentiation, formation of 3D villus-like axes, mucus production, and small intestinal gene expression patterns21. This microfluidic model was applied to neonatal disease with the development of the NEC-on-a-chip system, which incorporates neonatal intestinal enteroids, endothelial cells, and the microbiome from a neonate with NEC36. NEC-on-a-chip recapitulates many of the critical features of human NEC, including inflammatory gene expression, loss of specialized epithelial cells, and reduced gut barrier function36. Thus, this model has numerous applications in the study of NEC, including mechanistic studies and drug discovery. In this manuscript, a detailed protocol for the performance of the NEC-on-a-chip model is provided.

Pleins feux sur l’auteur : Améliorer la compréhension et les stratégies de traitement grâce au modèle NEC-on-a-Chip 

Modèle microfluidique d’entérocolite nécrosante incorporant des entéroïdes intestinaux néonatals humains et un microbiome dysbiotique

Research in this field is challenging because the pathophysiology of necrotizing enterocolitis is complex, and this complexity is not reflected in many commonly used in vitro models. Studies using human samples are often limited by small sample volumes and the rarity of samples obtained at the time of intestinal surgery. Our goal is to determine the mechanisms that lead to the development of NEC in preterm infants and to identify new treatment strategies.The NEC-on-a-Chip system improves upon previous models by more closely reflecting the physiology of the neonatal intestine. In this model, we combine patient-derived intestinal organoids, endothelial cells, and the microbiome from a neonate who had severe NEC onto the microfluidic chip.

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Modèle microfluidique d’entérocolite nécrosante sur puce pour l’étude de la physiopathologie de la NEC

Pour commencer, placez la puce et le support de puce dans le support de puce situé dans une boîte de culture tissulaire stérile et gardez-le de côté dans la hotte de culture tissulaire pendant la préparation du réactif d’activation de la puce. Ajouter un millilitre de solution de CR2 dans le flacon contenant de la poudre de CR1. Transférez la solution du flacon dans un tube de 15 millilitres enveloppé dans du papier d’aluminium.Répétez ce processus jusqu’à ce que quatre rinçages et quatre millilitres de CR2 aient été rincés dans le flacon de CR1. Pour le dernier rinçage, bouchez le flacon et retournez-le pour éliminer les résidus de poudre. Ensuite, ajoutez six millilitres de CR2 dans le tube de 15 millilitres contenant CR1.Mélangez la solution finale de 10 millilitres à l’aide d’une pipette sans introduire de bulles. À l’aide d’une pointe de pipette de 200 microlitres, ajoutez 20 microlitres de solution CR1 à l’entrée du canal inférieur de la puce jusqu’à ce que la solution commence à sortir de la sortie du canal inférieur. Ajouter 50 microlitres de solution CR1 par l’entrée du canal supérieur jusqu’à ce que la solution commence à sortir de la sortie du canal supérieur.Ensuite, placez les chips sous la lumière ultraviolette pendant 15 minutes. Après l’exposition, retirez toute solution CR1 des canaux supérieur et inférieur. Lavez les deux canaux avec 100 microlitres de solution CR2.Ensuite, lavez deux fois avec 100 microlitres de DPBS. Préparez les solutions de matrice extracellulaire pour les canaux supérieur et inférieur de la puce. Ajouter 50 microlitres de solution de matrice extracellulaire à l’entrée du canal inférieur jusqu’à ce que la goutte apparaisse à la sortie.Ensuite, ajoutez 50 microlitres à l’entrée du canal supérieur jusqu’à ce que la goutte apparaisse sur l’entrée. Ajoutez le DPBS dans le réservoir du support de puce. Placez le couvercle sur l’assiette et incubez les chips pendant la nuit à 37 degrés Celsius et 5% de dioxyde de carbone incubateur.Le lendemain, rincez l’épithélium ou le canal supérieur de la puce avec 100 microlitres de milieu d’expansion de puce préchauffé. Ensuite, rincez l’endothélium ou le canal inférieur avec 100 microlitres de milieu HIMEC préchauffé. Après le comptage, ajoutez 10 microlitres d’HIMECs dans le canal endothélial.Si nécessaire, ajouter un milieu de croissance organoïde ou un milieu d’expansion à puce dans le canal épithélial et vérifier la densité de semis des HIMEC. Ensuite, inversez la puce dans le berceau de la puce placé dans la boîte de culture cellulaire, ajoutez le DPBS dans le réservoir du berceau de la puce et placez la puce à 37 degrés Celsius pendant deux à trois heures pour permettre aux HIMEC de se fixer à la membrane de la puce. Après l’incubation, remettez le support de copeaux en position verticale.Lavez délicatement le canal endothélial avec 100 microlitres de milieu HIMEC chaud et le canal épithélial avec un milieu de croissance organoïde ou un milieu d’expansion de puce, en laissant le milieu dans le canal. Pour la récolte des entéroïdes, aspirez doucement le milieu et lavez les puits contenant l’hydrogel de matrice de culture cellulaire avec 500 microlitres de DPBS chaud. Ajoutez 250 microlitres de solution de récupération de cellules froides dans chaque puits et grattez le fond de chaque puits avec une pointe de pipette neuve pour perturber l’hydrogel de la matrice de culture cellulaire.Ajouter la suspension cellulaire perturbée dans un tube froid de 15 millilitres sur de la glace et incuber pendant 45 minutes. Après incubation, centrifugez la suspension et retirez le surnageant. Ensuite, ajoutez deux millilitres de milieu de dissociation entéroïde chaud à la pastille et placez le tube dans un bain-marie à 37 degrés Celsius.Pendant 60 à 120 secondes, ajoutez ensuite 10 millilitres de produit de lavage à froid dans le tube. Ensuite, centrifugez et retirez le surnageant avant de remettre la pastille en suspension dans 200 microlitres de fluide d’expansion à copeaux. À l’aide d’une pipette P200, dissociez les entéroïdes et ajoutez la suspension dans un microtube à centrifuger de 1,5 millilitre.Comptez les cellules et ajustez le volume du support d’expansion des puces pour obtenir une concentration de six fois 10 à six cellules par millilitre. Ensuite, ajoutez 30 microlitres de suspension cellulaire remise en suspension dans le canal supérieur de la puce. Après avoir remis les copeaux dans le berceau de la puce, ajoutez le DPBS dans le réservoir et incubez les copeaux pendant la nuit à 37 degrés Celsius et 5% de dioxyde de carbone.Le lendemain, rincez deux fois le canal épithélial avec 100 microlitres de média d’expansion de puce et le canal endothélial avec 100 microlitres de milieu HIMEC. Ensuite, ajoutez deux millilitres de produit d’expansion de copeaux dans le réservoir d’entrée du canal supérieur et 300 microlitres dans le réservoir de sortie du canal supérieur. Ajouter deux millilitres de média HIMEC dans le réservoir d’entrée du canal inférieur et 300 microlitres dans le réservoir de sortie du canal inférieur.Amorcez les gousses et ajoutez les copeaux aux gousses. Ajoutez ensuite les gousses au module de culture. Réglez un débit de 30 microlitres par heure et lancez le cycle.Les cellules épithéliales intestinales cultivées à l’aide de l’intestin néonatal sur une puce ont formé une monocouche de cellules confluentes, puis se sont développées en une structure tridimensionnelle mature ressemblant à des villosités. L’ajout d’un microbiome dysbiotique d’un nouveau-né atteint d’entérocolite nécrosante sévère à l’intestin néonatal sur un modèle de puce a montré une expression accrue du TNF-alpha par rapport au témoin.

Research

JoVE Journal

Medicine

Microfluidic Necrotizing Enterocolitis-on-a-Chip Model for Studying NEC Pathophysiology

Microfluidic Model of Necrotizing Enterocolitis Incorporating Human Neonatal Intestinal Enteroids and a Dysbiotic Microbiome

Necrotizing enterocolitis (NEC) is a severe and potentially fatal intestinal disease that has been difficult to study due to its complex pathogenesis, ...