Name: NEC 병태생리학 연구를 위한 미세유체 괴사성 장염 온 칩 모델
Uploaded: 2023-07-28T12:10:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Microfluidic Necrotizing Enterocolitis-on-a-Chip Model for Studying NEC Pathophysiology at JoVE.com

microfluidic necrotizing enterocolitis-on-a-chip model for studying nec pathophysiology

기계론적 연구 및 약물 발견을 위한 괴사성 장염 모델

Necrotizing enterocolitis (NEC) affects preterm infants, with an incidence of up to 10% in those born weighing &#60; 1500 g1. The pathophysiology of NEC is complex and includes damage to the intestinal epithelium, disruption of intestinal tight junctions, increased gut barrier permeability, immune dysregulation, and epithelial cell death2,3. Our understanding of the mechanisms involved in the pathogenesis of NEC remains incomplete, and despite decades of research, there are still no effective targeted therapies.
A significant barrier to advancing NEC research is the limited availability and small size of primary intestinal tissue isolated from human infants. Intestinal tissue resected from infants with NEC is often necrotic and severely damaged, which complicates studies into mechanisms that precede disease onset. For example, the small intestine of infants with NEC is inundated with immune cells, and a reduced number of intestinal stem cells, decreased epithelial cell proliferation, and increased epithelial cell apoptosis are also observed4,5,6,7. This leads to difficulties in culturing intestinal epithelial cells from these samples and in isolating RNA and proteins, which can be degraded in this hostile inflammatory environment. Additionally, since the disease process is already advanced in infants with surgical NEC, mechanistic studies into factors that induce disease are unfeasible. These limitations have led to a reliance on animal models for mechanistic studies of NEC.
Animal models of NEC have been established for mice, rats, piglets, rabbits, and baboons5,8,9,11. A strength of animal&#160;models is that NEC-like intestinal disease is induced by factors associated with NEC onset in humans, including a dysbiotic microbiome, repeated episodes of hypoxia, and the absence of breast milk feeds5,8,10,11. In addition, the inflammatory response and pathologic changes observed during experimental NEC parallel human disease5,9,12. While these models mimic many of the features of human NEC, there are inherent differences between the pathophysiology of NEC in animals and humans. For example, the murine model of NEC is induced in mice born full-term, and although their intestinal development is incomplete, the pathophysiology of NEC is inherently different in this clinical context. Murine intestinal gene expression at birth is similar to a pre-viable human fetus and does not approximate that of a preterm neonate of 22-24 weeks gestation until day 14 (P14)13. This confounds the murine NEC model because intestinal injury cannot generally be induced in mice after P10. In addition, inbred strains of mice lack the immunologic14 and microbiologic diversity of human neonates15, which serves as another confounding factor. Thus, increased incorporation of primary human samples into NEC research improves the clinical relevance of studies in this field.
Studies into the mechanisms of NEC in vitro have traditionally utilized monotypic cell lines derived from adult intestinal cancer cells, such as colorectal adenocarcinoma (Caco2) and human colon adenocarcinoma (HT-29) cells16. These models are convenient but limited in physiologic relevance due to their growth from adult cancer cells, non-polarized architecture, and phenotypic changes related to repeated passages in culture. Intestinal enteroids improve upon those models since they can be grown from the crypts of intestinal tissue, differentiated into all intestinal epithelial subtypes, and form a three-dimensional (3D) villus-like structure17,18,19,20. Recently, intestinal enteroids have been combined with microfluidic technology to develop a small intestine-on-a-chip model and provide a more physiologically relevant in vitro model system21.
The initial organ-on-a-chip microfluidic devices were introduced in the early 2000s22,23,24. The first organ-on-a-chip model was the human breathing lung-on-a-chip25. This was followed by numerous single-organ models such as intestine21, liver26, kidneys27, bone marrow28, blood-brain barrier29, and heart30. These organ-on-a-chip models have been used to study acute, chronic, and rare diseases, including acute radiation syndrome,31 chronic obstructive pulmonary disease,32 and neurodegenerative diseases33. The polarized nature of the cells on these chips and the presence of two cellular compartments separated by a porous membrane allows for the modeling of complex physiologic processes such as perfusion, chemical concentration gradients, and immune cell chemotaxis34,35. These microfluidic systems thus provide a new tool for studying the pathophysiology and mechanisms of human disease.
The small intestine-on-a-chip model was described by Kasendra et al. in 2018, who utilized pediatric (ages 10-14 years old) small intestinal biopsy specimens differentiated into enteroids and cultured on a microfluidic device21. Vascular endothelial cells, continuous media flow, and stretch/relaxation were also incorporated into this model. They observed intestinal epithelial subtype differentiation, formation of 3D villus-like axes, mucus production, and small intestinal gene expression patterns21. This microfluidic model was applied to neonatal disease with the development of the NEC-on-a-chip system, which incorporates neonatal intestinal enteroids, endothelial cells, and the microbiome from a neonate with NEC36. NEC-on-a-chip recapitulates many of the critical features of human NEC, including inflammatory gene expression, loss of specialized epithelial cells, and reduced gut barrier function36. Thus, this model has numerous applications in the study of NEC, including mechanistic studies and drug discovery. In this manuscript, a detailed protocol for the performance of the NEC-on-a-chip model is provided.

저자 스포트라이트: NEC-on-a-Chip 모델을 통한 이해 및 치료 전략 강화 

인간 신생아 장 장내염과 디스바이오틱 마이크로바이옴을 통합한 괴사성 장염의 미세유체 모델

Research in this field is challenging because the pathophysiology of necrotizing enterocolitis is complex, and this complexity is not reflected in many commonly used in vitro models. Studies using human samples are often limited by small sample volumes and the rarity of samples obtained at the time of intestinal surgery. Our goal is to determine the mechanisms that lead to the development of NEC in preterm infants and to identify new treatment strategies.The NEC-on-a-Chip system improves upon previous models by more closely reflecting the physiology of the neonatal intestine. In this model, we combine patient-derived intestinal organoids, endothelial cells, and the microbiome from a neonate who had severe NEC onto the microfluidic chip.

Watch this Scientific Journal Video about Microfluidic Necrotizing Enterocolitis-on-a-Chip Model for Studying NEC Pathophysiology at JoVE.com

NEC 병태생리학 연구를 위한 미세유체 괴사성 장염 온 칩 모델

시작하려면 칩 및 칩 캐리어를 멸균 조직 배양 접시에 있는 칩 크래들에 넣고 칩 활성화 시약을 준비하는 동안 조직 배양 후드에 따로 보관합니다. CR2 분말이 들어 있는 바이알에 CR1 용액 1밀리리터를 추가합니다. 바이알에서 알루미늄 호일로 감싼 15밀리리터 튜브로 용액을 옮깁니다.4번의 헹굼과 4밀리리터의 CR2가 CR1 바이알을 통해 플러시될 때까지 이 과정을 반복합니다. 마지막 헹굼을 위해 바이알의 뚜껑을 닫고 뒤집어 잔류 분말을 제거합니다. 다음으로, CR1이 포함된 15밀리리터 튜브에 CR2 6밀리리터를 추가합니다.마지막 10밀리리터 용액을 기포 없이 피펫과 혼합합니다. 200마이크로리터 피펫 팁을 사용하여 용액이 하단 채널 출구에서 나오기 시작할 때까지 칩의 하단 채널 입구에 20마이크로리터의 CR1 용액을 추가합니다. 용액이 상단 채널 출구에서 나오기 시작할 때까지 상단 채널 입구를 통해 50마이크로리터의 CR1 용액을 추가합니다.그런 다음 칩을 자외선 아래에 15분 동안 둡니다. 노출 후 상단 및 하단 채널에서 CR1 용액을 제거합니다. 100마이크로리터의 CR2 용액으로 두 채널을 세척합니다.그런 다음 100마이크로리터의 DPBS로 두 번 씻으십시오. 칩의 상단 및 하단 채널에 대한 세포외 기질 용액을 준비합니다. 50 마이크로리터의 세포외 기질 용액을 출구에 방울이 나타날 때까지 하단 채널 입구에 추가합니다.그런 다음 드롭이 입구에 나타날 때까지 상단 채널 입구에 50마이크로리터를 추가합니다. 칩 크래들 저장소에 DPBS를 추가합니다. 접시에 뚜껑을 덮고 섭씨 37도에서 밤새 칩을 배양하고 이산화탄소 인큐베이터 5%를 배양합니다.다음 날, 100마이크로리터의 예열된 칩 팽창 매체로 칩의 상피 또는 상단 채널을 세척합니다. 그런 다음 100마이크로리터의 미리 예열된 HIMEC 배지로 내피 또는 바닥 채널을 세척합니다. 계산 후 10 마이크로 리터의 HIMEC를 내피 채널에 첨가하십시오.필요한 경우 오가노이드 성장 배지 또는 칩 확장 배지를 상피 채널에 추가하고 HIMEC의 파종 밀도를 확인합니다. 다음으로, 칩을 세포 배양 접시에 놓인 칩 크래들에 넣고 칩 크래들의 저장소에 DPBS를 추가한 다음 칩을 섭씨 37도에 2-3시간 동안 두어 HIMEC이 칩 멤브레인에 부착되도록 합니다. 배양 후 칩 크래들을 똑바로 세웁니다.100마이크로리터의 따뜻한 HIMEC 배지로 내피 채널을 부드럽게 세척하고 오가노이드 성장 배지 또는 칩 확장 배지로 상피 채널을 세척하여 배지를 채널에 남겨둡니다. 엔테로이드 채취를 위해 배지를 부드럽게 흡입하고 세포 배양 매트릭스 하이드로겔이 들어 있는 웰을 500마이크로리터의 따뜻한 DPBS로 세척합니다. 각 웰에 250마이크로리터의 콜드 셀 회수 용액을 추가하고 새 피펫 팁으로 각 웰의 바닥을 긁어 세포 배양 매트릭스 하이드로겔을 방해합니다.파쇄된 세포 현탁액을 얼음 위의 차가운 15밀리리터 튜브에 넣고 45분 동안 배양합니다. 배양 후 현탁액을 원심분리하고 상층액을 제거합니다. 그런 다음 펠릿에 2ml의 따뜻한 장내 해리 배지를 추가하고 튜브를 섭씨 37도의 수조에 넣습니다.60-120초 동안 10mL의 차가운 조직 세척제를 튜브에 넣습니다. 그런 다음, 펠릿을 200 마이크로리터의 칩 팽창 매체에 다시 현탁시키기 전에 상층액을 원심분리하고 제거합니다. P200 피펫을 사용하여 장내염액을 분리하고 현탁액을 1.5밀리리터 마이크로 원심분리기 튜브에 추가합니다.셀을 계산하고 칩 팽창 매체의 부피를 조정하여 밀리리터당 6개의 셀에 10의 6배 농도를 달성합니다. 그런 다음 30마이크로리터의 재현탁 셀 현탁액을 칩의 상단 채널에 추가합니다. 칩을 칩 크래들로 되돌린 후 저장소에 DPBS를 추가하고 섭씨 37도, 이산화탄소 5%에서 밤새 칩을 배양합니다.다음날 100 마이크로 리터의 칩 확장 매체로 상피 채널을 두 번 플러시하고 100 마이크로 리터의 HIMEC 배지로 내피 채널을 플러시합니다. 그런 다음 2밀리리터의 칩 팽창 매체를 상단 채널 입구 저장소에 추가하고 300마이크로리터를 상단 채널 출구 저장소에 추가합니다. 하단 채널 입구 저장소에 2밀리리터의 HIMEC 매체를 추가하고 하단 채널 출구 저장소에 300마이크로리터를 추가합니다.포드를 프라이밍하고 포드에 칩을 추가합니다. 그런 다음 culture 모듈에 Pod를 추가합니다. 시간당 30마이크로리터의 유속을 설정하고 사이클을 시작합니다.신생아 장을 칩에 사용하여 성장한 장 상피 세포는 융합 세포 단층을 형성한 후 성숙한 3차원 융모 유사 구조로 발달했습니다. 중증 괴사성 장염을 앓고 있는 신생아의 디스바이오틱 마이크로바이옴을 신생아 장 온 칩 모델에 추가한 결과, 대조군에 비해 TNF-알파 발현이 증가한 것으로 나타났습니다.

Research

JoVE Journal

Medicine

Microfluidic Necrotizing Enterocolitis-on-a-Chip Model for Studying NEC Pathophysiology

Microfluidic Model of Necrotizing Enterocolitis Incorporating Human Neonatal Intestinal Enteroids and a Dysbiotic Microbiome

Necrotizing enterocolitis (NEC) is a severe and potentially fatal intestinal disease that has been difficult to study due to its complex pathogenesis, ...