Name: تركيب والتقاط صورة الأنابيب الدقيقة ليرقات ذبابة الفاكهة
Uploaded: 2023-10-20T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Mounting and Image Acquisition of Drosophila Larval Microtubules at JoVE.com

mounting and image acquisition of drosophila larval microtubules

عرض شبكات الأنابيب الدقيقة في تقاطعات ذبابة الفاكهة العصبية العضلية وخلايا العضلات

Microtubules (MTs), as one of the structural components of the cytoskeleton, play an important role in diverse biological processes, including cell division, cell growth and motility, intracellular transport, and the maintenance of cell shape. Microtubule dynamics and function are modulated by interactions with other proteins, such as MAP1, MAP2, Tau, Katanin, and Kinesin1,2,3,4,5.
In neurons, microtubules are essential for the development and maintenance of axons and dendrites. Abnormalities in microtubules lead to dysfunction and even the death of neurons. For instance, in the brain of Alzheimer&#39;s patients, Tau protein hyperphosphorylation reduces the stability of the microtubule network, causing neurological irregularities6. Thus, examining microtubule networks will contribute to a comprehension of neurodevelopment and the pathogenesis of neurological diseases.
The neuromuscular junction (NMJ) is the peripheral synapse formed between a motor neuron axon terminal and a muscle fiber, which is an excellent and powerful model system for studying synaptic structure and functions7. Futsch is a protein in Drosophila that is homologous to the microtubule-binding protein MAP1B found in mammals8. It is expressed only in neurons and plays a role in the development of the NMJ&#39;s synaptic buttons8,9. In wild-type, filamentous bundles that run along the center of NMJ processes are visualized by immunostaining with anti-Futsch. When reaching NMJ&#39;s end, this bundle has the ability to either form a loop consisting of microtubules or to lose its filamentous structure, resulting in a diffuse and punctate appearance10. Microtubule loops are associated with paused growth cones, which suggests the microtubule array is stable11. Therefore, we can indirectly determine the stable microtubule development in NMJ by Futsch staining. The large size of muscle cells in Drosophila larva allows for clear visualization of the microtubule network. The factors affecting the stability of the microtubule network can be found by analyzing the density and shape of microtubules. Simultaneously, the microtubule network status of muscle cells can be cross-verified with the result of NMJ to obtain more comprehensive conclusions.
Many protocols have been employed for investigating the network and dynamics of microtubules. However, these researches have often focused on in vitro studies12,13,14,15,16. Alternatively, some in vivo experiments have employed electron microscopy to detect the cytoskeleton17. According to the specific binding of fluorescently labeled antibodies or chemical dyes to proteins or DNA, the methods presented here allow the detection of microtubule networks in NMJ at the level of individual neurons in vivo, with results corroborated by observations in muscle cells. This protocol is simple, stable, and repeatable when combined with the powerful genetic tools available in Drosophila melanogaster, enabling a diverse range of phenotypic examinations and genetic screenings for the role of microtubule network regulatory proteins in the nervous system in vivo.

تسليط الضوء على المؤلف: فهم شبكة الأنابيب الدقيقة في تقاطعات ذبابة الفاكهة العصبية العضلية 

استخدام ذبابة الفاكهة اليرقات العصبية العضلية والخلايا العضلية لتصور شبكة الأنابيب الدقيقة

Currently, microtubule dynamics are observed indirectly through microtubule-binding proteins such as EB1. Since alphabeta tubulin heterodimers are abundant in the cytoplasm, fold directly, neighboring tubulin heterodimers are lacking the dynamics of microtubule networks in vivo. Our protocol visualizes microtubules in neuromuscular synapses and muscle cells.When combined with the powerful genetic tools available in Drosophila melanogaster, enabling a diverse range of phenotypic examinations and the genetic screening for the role of microtubule network regulatory proteins in the nervous system in vivo. Our research focuses on the relationship between the cytoskeleton and the neurodevelopment, as well as its implications for neurological diseases. We hope to discover the mechanism of neurodevelopment and the parthenogenesis for neurological diseases by highlighting the effect of cytoskeletal regulatory proteins on neurons.

Watch this Scientific Journal Video about Mounting and Image Acquisition of Drosophila Larval Microtubules at JoVE.com

تركيب والتقاط صورة الأنابيب الدقيقة ليرقات ذبابة الفاكهة

ابدأ بوضع الجسم المضاد المسمى ذبابة الفاكهة جثث اليرقات في 0.2٪ PBST على شريحة زجاجية. يتم ضبطه تحت المجهر الاستريو ، مما يضمن أن السطح الداخلي لجثة اليرقات مواجه لأعلى. استوعب محلول PBST الزائد باستخدام مسح.ثم أضف بدقة قطرة من وسيط التثبيت المضاد للتلاشي. بعد ذلك ، ضع غطاء منزلق على الشريحة التي تغطي اليرقات المشرحة ببطء ورفق ، وتجنب تكوين الفقاعة. ثبت غطاء الغطاء في مكانه عن طريق وضع طلاء الأظافر حول حوافه.قم بتخزين الشريحة في مكان مظلم لتقليل توهين الفلورسنت. للحصول على الصور ، استخدم مجهر المسح بالليزر متحد البؤر مع هدف غمر الزيت 63x. ثم اضبط الطول الموجي وطاقة الليزر لتناسب متطلبات التجربة بشكل أفضل.لتحديد التقاطعات العصبية العضلية والتقاط صور للعضلة الرابعة في الجزء A III ، حدد ليزر 488 نانومتر لتنشيط alpha tubulin أو Futsch ، و 546 نانومتر لتنشيط مسار تصوير HRP. قم بتعديل المعلمات لتحقيق حجم إطار 1،024 × 1،024 بكسل ، وتقريب رقمي 1.0 ، وفاصل تصوير يبلغ 0.8 ميكرومتر. لتصور الأنابيب الدقيقة في العضلات ، التقط صورا للعضلة اثنين في الأجزاء من ثلاثة إلى خمسة لأنها تحتوي على عدد أقل من فروع القصبة الهوائية.اختر ليزر 488 نانومتر لتنشيط ألفا توبولين وليزر 633 نانومتر لتنشيط مسار التصوير T3605. اضبط معلمات التصوير على حجم إطار 1 ، 024 × 1 ، 024 بكسل ، وتكبير رقمي 2.0 ، وفاصل تصوير يبلغ 0.4 ميكرومتر. تم تصنيف كل من منظمات الأنابيب الدقيقة قبل وبعد المشبكي للوصلة العصبية العضلية بتوبولين مضاد ألفا.يعكس تلطيخ Futsch وفرة الأنابيب الدقيقة المستقرة في الخلايا العصبية قبل المشبكية. لوحظ انخفاض شدة إشارة مضاد Futsch عندما تم التعبير عن الأنابيب الدقيقة التي تقطع بروتين Katanin 60 بشكل مفرط في الخلايا العصبية قبل المشبكية. كانت شدة تلطيخ الجذع المحوري أقوى من شدة تلطيخ الفروع.أدت طفرات Katanin 60 إلى زيادة حلقات الأنابيب الدقيقة. تسبب الإفراط في التعبير عن Katanin 60 في شظايا الأنابيب الدقيقة القصيرة داخل الأزرار الطرفية. أظهر تلطيخ توبولين ألفا شبكة واضحة من الأنابيب الدقيقة حول النواة.كان لدى خلايا العضلات زيادة كبيرة في شدة الأنابيب الدقيقة المحيطة بالنواة وأظهرت حزما أقوى في طفرة Katanin 60. أدى الإفراط في التعبير إلى تفتيت ألياف الأنابيب الدقيقة.