bacterial inoculation and paraformaldehyde inactivation for caenorhabditis elegans research

تعطيل التمثيل الغذائي البكتيري في Caenorhabditis elegans باستخدام بارافورمالدهيد

Caenorhabditis elegans was originally proposed as a model organism in 19651 and has since been widely adopted in studies of genetics, development, behavior, aging, and metabolism2. Due to their large brood size and transparent cuticle, C. elegans is particularly well-suited for high-throughput screening with fluorescent reporters3. Their short life cycle, hermaphroditic reproduction, and genetic homology with humans also make C. elegans a valuable model system for studies on development4 and aging biology5. Moreover, C. elegans are relatively easy to maintain. Worms can be grown in liquid culture or on solid agar plates and consume a diet of live Escherichia coli OP50 bacteria4.
However, the live food source of C. elegans can confound studies of metabolism, drug supplementation, and behavior. Because live bacteria have their own metabolism, experimental conditions that affect the bacteria also alter the nutrients and metabolites available to the worms. For example, differences in bacterial iron, amino acid, and folate concentrations have diverse effects on C. elegans&#39; development, physiology, and lifespan6. Many common lab practices can elicit such changes in the nutrient composition and metabolites produced by OP50. Specifically, exposure to 5-fluoro-2&#39;-deoxyuridine (FUdR), a compound commonly used to prevent reproduction in C. elegans, elicits broad changes in OP50 gene expression, including amino acid biosynthesis pathways7. Live bacteria can also confound studies in which C. elegans are supplemented with small molecules because bacteria can partially or completely metabolize the active compounds. Moreover, the effects of these small molecules on the bacteria can, in turn, alter C. elegans physiology, as was reported with the lifespan-extending drug metformin8. Finally, live bacteria can change the worm&#39;s environment in ways that alter behavior, such as secreting attractive odorants9, producing exogenous neuromodulators10, and creating oxygen gradients in a dense bacteria lawn11.
To mitigate the confounding effects of bacterial metabolism on C. elegans research, multiple methods for killing bacteria have been developed (Table 1). Three common strategies for killing OP50 are UV-irradiation, heat-killing, and antibiotic treatment. While straightforward and relatively low-cost, each of these methods can have undesirable effects on both bacteria and C. elegans. UV-killing via a UV crosslinker12 is low-throughput and the rate is limited by the number of plates that can fit in the UV crosslinker. Moreover, the efficacy of UV-killing can vary from plate to plate within a batch, and testing for growth on all plates can become difficult in large experiments. Heat-killing OP50 by exposing culture to temperatures of &#62;60 &#176;C comes with a separate set of challenges. High heat can damage nutrients essential for the worm and destroy the cellular structure of bacteria, creating a softer texture that decreases the amount of time worms spend on the food13. This method also cannot be used throughout the life cycle of C. elegans because worms fed heat-killed bacteria can arrest early in development13. Antibiotic treatment is a third common method for suppressing bacterial metabolism14, but antibiotics can also alter worm growth and metabolism15.
One solution to eliminate the metabolic effects of live bacteria while preserving bacterial structure and essential nutrients is to kill OP50 with paraformaldehyde (PFA)16. PFA is a polymer of formaldehyde that can crosslink proteins within cells17 to prevent bacterial replication without destroying internal cell structures like the inner plasma membrane18. Due to this preservation of internal cellular structure, PFA-treated bacteria exhibit no growth or metabolic activity but remain an edible and nutrient-rich food source for C. elegans16. Here, a detailed protocol is provided which shows how to metabolically inactivate bacteria using paraformaldehyde.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Method</td>
			<td>Required Materials</td>
			<td colspan="2">Scalable?</td>
			<td>Nutritional?</td>
			<td colspan="4">Effects on Worm?</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="4">UV</td>
			<td rowspan="4">UV-crosslinker</td>
			<td colspan="2">Limited by:</td>
			<td rowspan="4">Yes</td>
			<td colspan="4">Variable effects on lifespan on NGM12, 23, 24</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">Number of plates that fit in UV-crosslinker</td>
			<td colspan="4">Variable effects on lifespan on FUdR24, 26, 27</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">Irradiation time per plate</td>
			<td colspan="4" rowspan="2">Decreased food preference16</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">Ability to check every plate for growth8</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="3">Heat</td>
			<td rowspan="3">&#62;60 &#176;C incubator</td>
			<td colspan="2" rowspan="3">Yes</td>
			<td rowspan="3">No: destroys cell wall, decreased nutritional value</td>
			<td colspan="4">Developmental arrest 13</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">Decreased food preference13</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">Extends lifespan on NGM31</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="3">Antibiotics</td>
			<td rowspan="3">Antibiotics (kanamycin, carbenicillin, etc.)</td>
			<td colspan="2" rowspan="3">Yes</td>
			<td rowspan="3">Yes</td>
			<td colspan="4">Delays growth and development15</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">Extends lifespan in liquid media19</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">Extends lifespan on NGM15</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="3">PFA</td>
			<td rowspan="3">0.5% Paraformaldehyde</td>
			<td colspan="2" rowspan="3">Yes</td>
			<td rowspan="3">Yes</td>
			<td colspan="4">Small brood size decrease16</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">Small development time increase16</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">Decreased food preference16</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Table 1. Comparisons of methods to kill OP50. UV-killing, heat-killing, antibiotic-treatment, and PFA-treatment have varied effects on the nutritional status of the bacteria and the health of worms fed treated bacteria. These methods for replicatively inactivating E. coli also differ in their required materials and scalability.

تسليط الضوء على المؤلف: تطوير أبحاث Caenorhabditis elegans باستخدام البكتيريا المعالجة بالبارافورمالديهايد 

منهجية لتعطيل البكتيريا الأيضية لأبحاث التهاب Caenorhabditis elegans

A challenge in sea elegance research is isolating the effects of a live bacterial diet from the effects of experimental manipulations. It can be difficult to determine whether the manipulation directly impacts the host or indirectly impacts the worms through a host microbiome interactions. Paraformaldehyde treated bacteria address the challenge of isolating the effects of bacterial metabolism from host physiology.Paraformaldehyde treatment is high throughput and consistently renders the bacteria replicate and metabolically inactive. In addition to its consistency PFA treated bacteria remain a palatable and nutritious food source.

Watch this Scientific Journal Video about Bacterial Inoculation and Paraformaldehyde Inactivation for  Caenorhabditis elegans  Research at JoVE.com

Bacterial Inoculation and Paraformaldehyde Inactivation for  Caenorhabditis elegans  Research  

التلقيح البكتيري وتعطيل بارافورمالدهيد لأبحاث التهاب الكانورهابديتيس ايليجانس

ابدأ بتلقيح مستعمرة بكتيرية واحدة في 200 ملليلتر من مرق لوريا المعقم في دورق إرلنماير سعة 500 ملليلتر. استزرع البكتيريا بين عشية وضحاها في حاضنة شاكر محددة عند 37 درجة. بعد 14 ساعة من الثقافة ، تحقق من الكثافة البصرية للبكتيريا عند 600 نانومتر.قسمة البكتيريا في أنابيب مخروطية سعة 50 ملليلتر وتخزينها عند أربع درجات مئوية لاستخدامها مرة أخرى. باستخدام ماصة مصلية ، انقل 50 ملليلترا من المزرعة البكتيرية إلى دورق Erlenmeyer جديد سعة 250 ملليلتر المسمى الأنابيب للتحكم الحي أو المعالج بالصور. استخدم ماصة مصلية لنقل 50 ملليلتر من البكتيريا إلى أنبوب مخروطي سعة 50 ملليلتر للتحكم المعالج قبل الغسيل.في الغطاء الكيميائي ، أضف 781 ميكرولترا من بارافورمالدهايد إلى المزرعة البكتيرية لتحقيق تركيز نهائي بنسبة 0.5٪ تخلص من الطرف المستخدم في حاوية المخاطر الكيميائية للنفايات الصلبة. بعد ذلك ، قم بتغطية القارورة بورقة من ورق القصدير وضعها في حاضنة شاكر عند 37 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة. بمجرد اكتمال الحضانة ، اغسل البكتيريا لإزالة أي بارافورمالدهيد متبقي.لإزالة بارافورمالدهيد المتبقي ، باستخدام ماصة مصلية ، قم بنقل البكتيريا المعالجة من قارورة Erlenmeyer إلى أنبوب مخروطي سعة 50 ملليلتر. الطرد المركزي التالي البكتيريا المعالجة في حوالي 3000 غرام لمدة 20 دقيقة. تخلص من المادة الطافية في حاوية خطر كيميائي للنفايات السائلة داخل الغطاء الكيميائي.أضف الآن 25 ملليلترا من مرق لوريا إلى الكريات البكتيرية المعالجة والتحكم ، ودوامة لإعادة تعليق الكريات البكتيرية. كرر الطرد المركزي وإعادة تعليق الحبيبات أربع مرات. استعدادا للمقايسات المختلفة ، أعد تعليق الحبيبات بأحجام مناسبة.لمقايسات العمر. بذر 200 ميكرولتر من البكتيريا المعاد تعليقها في 10 ملليلتر من مرق لوريا على ألواح 60 ملم. قم بتخزين البكتيريا عند أربع درجات مئوية.لإجراء فحص جودة نمو البكتيريا ، قم بخط طبق مرق لوريا ببكتيريا محضرة باستخدام طرف ماصة معقم. للتحقق من التلوث ، شريحة لحم مرق لوريا المستخدمة للغسيل والتعليق على طبق منفصل. بعد ذلك ضع الألواح في حاضنة 37 درجة مئوية طوال الليل.في اليوم التالي ، تحقق من وجود أي نمو بكتيري. احفظ البكتيريا إذا نجح تحضير الألدهيد البارفورم وفشلت المستعمرات في النمو على لوحة LB. للتحقق من النشاط الأيضي البكتيري باستخدام مقياس التنفس ، قم أولا بترطيب الخرطوشة بإضافة 200 ميكرولتر من المعايرة إلى جميع الآبار على لوحة 96 بئرا.ضع الخرطوشة في لوحة 96 بئرا واحتضانها طوال الليل عند 37 درجة مئوية. اضبط الجهاز على الخلط والوزن والقياس والحلقة. في اليوم التالي ، ضع الخرطوشة المائية في الجهاز.إلى صفيحة جديدة مكونة من 96 بئرا ، أضف 160 ميكرولترا من M9 إلى آبار الاختبار ، متبوعة ب 40 ميكرولترا من البكتيريا الجاهزة. أضف 200 ميكرولتر من M9 إلى آبار الزاوية الأربعة لتكون بمثابة فراغات. استغني عن 160 ميكرولترا من M9 و 40 ميكرولترا من مرق لوريا كضوابط سلبية.أخيرا ، ماصة 200 ميكرولتر من M9 في الآبار المتبقية غير المستخدمة. ثم استبدل لوحة المعايرة المقذوفة بلوحة الفحص قبل تشغيل البرنامج. سيتم عرض النتائج كمعدل استهلاك الأكسجين.أظهرت السلالات المختلفة أوقات استجابة تعطيل مختلفة للبارافورمالدهايد. على سبيل المثال ، التعرض لبكتيريا HB101 إلى 0.25٪ لمدة ساعة واحدة يكفي لجعلها غير نشطة أيضيا. تتطلب المكورات المعوية البرازية تركيزا بنسبة 1.0٪ للحصول على تأثير ثابت.أظهرت ديدان Caenorhabditis elegans تفضيلات مماثلة تجاه سلالات OP 50 المعالجة بالإضافة إلى التحكم المعالج بالوهم. ومع ذلك ، كشف الفحص الزوجي الحساس عن تفضيل أقوى للتحكم في العلاج الوهمي. الديدان على OP 50 المعالجة لديها معدل ضخ أعلى من الديدان على السيطرة المعالجة وهمية.أدى استهلاك البكتيريا المعالجة إلى تأخر وقت النمو في الديدان البرية ، فضلا عن انخفاض قدرة وضع البيض. لم يكن عمر الديدان مختلفا بشكل كبير عن بعضها البعض ، بغض النظر عن مصدر الغذاء. ومع ذلك ، فإن البكتيريا المعالجة بالبارافورمالدهايد زادت من عمر الدودة في وجود 5-Fluoro-2'deoxyuridine لم يغير استهلاك البكتيريا المعالجة بالبارافورمالدهايد بواسطة سلالة دودة طويلة العمر طول عمرها.

Research

JoVE Journal

Biology

Bacterial Inoculation and Paraformaldehyde Inactivation for Caenorhabditis elegans Research

Methodology to Metabolically Inactivate Bacteria for Caenorhabditis elegans Research

Caenorhabditis elegans is a common model organism for research in genetics, development, aging, metabolism, and behavior. Because C. elegans consume a ...