bacterial inoculation and paraformaldehyde inactivation for caenorhabditis elegans research

Bakterielle metabolische Inaktivierung bei Caenorhabditis elegans unter Verwendung von Paraformaldehyd

Caenorhabditis elegans was originally proposed as a model organism in 19651 and has since been widely adopted in studies of genetics, development, behavior, aging, and metabolism2. Due to their large brood size and transparent cuticle, C. elegans is particularly well-suited for high-throughput screening with fluorescent reporters3. Their short life cycle, hermaphroditic reproduction, and genetic homology with humans also make C. elegans a valuable model system for studies on development4 and aging biology5. Moreover, C. elegans are relatively easy to maintain. Worms can be grown in liquid culture or on solid agar plates and consume a diet of live Escherichia coli OP50 bacteria4.
However, the live food source of C. elegans can confound studies of metabolism, drug supplementation, and behavior. Because live bacteria have their own metabolism, experimental conditions that affect the bacteria also alter the nutrients and metabolites available to the worms. For example, differences in bacterial iron, amino acid, and folate concentrations have diverse effects on C. elegans&#39; development, physiology, and lifespan6. Many common lab practices can elicit such changes in the nutrient composition and metabolites produced by OP50. Specifically, exposure to 5-fluoro-2&#39;-deoxyuridine (FUdR), a compound commonly used to prevent reproduction in C. elegans, elicits broad changes in OP50 gene expression, including amino acid biosynthesis pathways7. Live bacteria can also confound studies in which C. elegans are supplemented with small molecules because bacteria can partially or completely metabolize the active compounds. Moreover, the effects of these small molecules on the bacteria can, in turn, alter C. elegans physiology, as was reported with the lifespan-extending drug metformin8. Finally, live bacteria can change the worm&#39;s environment in ways that alter behavior, such as secreting attractive odorants9, producing exogenous neuromodulators10, and creating oxygen gradients in a dense bacteria lawn11.
To mitigate the confounding effects of bacterial metabolism on C. elegans research, multiple methods for killing bacteria have been developed (Table 1). Three common strategies for killing OP50 are UV-irradiation, heat-killing, and antibiotic treatment. While straightforward and relatively low-cost, each of these methods can have undesirable effects on both bacteria and C. elegans. UV-killing via a UV crosslinker12 is low-throughput and the rate is limited by the number of plates that can fit in the UV crosslinker. Moreover, the efficacy of UV-killing can vary from plate to plate within a batch, and testing for growth on all plates can become difficult in large experiments. Heat-killing OP50 by exposing culture to temperatures of &#62;60 &#176;C comes with a separate set of challenges. High heat can damage nutrients essential for the worm and destroy the cellular structure of bacteria, creating a softer texture that decreases the amount of time worms spend on the food13. This method also cannot be used throughout the life cycle of C. elegans because worms fed heat-killed bacteria can arrest early in development13. Antibiotic treatment is a third common method for suppressing bacterial metabolism14, but antibiotics can also alter worm growth and metabolism15.
One solution to eliminate the metabolic effects of live bacteria while preserving bacterial structure and essential nutrients is to kill OP50 with paraformaldehyde (PFA)16. PFA is a polymer of formaldehyde that can crosslink proteins within cells17 to prevent bacterial replication without destroying internal cell structures like the inner plasma membrane18. Due to this preservation of internal cellular structure, PFA-treated bacteria exhibit no growth or metabolic activity but remain an edible and nutrient-rich food source for C. elegans16. Here, a detailed protocol is provided which shows how to metabolically inactivate bacteria using paraformaldehyde.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Method</td>
			<td>Required Materials</td>
			<td colspan="2">Scalable?</td>
			<td>Nutritional?</td>
			<td colspan="4">Effects on Worm?</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="4">UV</td>
			<td rowspan="4">UV-crosslinker</td>
			<td colspan="2">Limited by:</td>
			<td rowspan="4">Yes</td>
			<td colspan="4">Variable effects on lifespan on NGM12, 23, 24</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">Number of plates that fit in UV-crosslinker</td>
			<td colspan="4">Variable effects on lifespan on FUdR24, 26, 27</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">Irradiation time per plate</td>
			<td colspan="4" rowspan="2">Decreased food preference16</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">Ability to check every plate for growth8</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="3">Heat</td>
			<td rowspan="3">&#62;60 &#176;C incubator</td>
			<td colspan="2" rowspan="3">Yes</td>
			<td rowspan="3">No: destroys cell wall, decreased nutritional value</td>
			<td colspan="4">Developmental arrest 13</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">Decreased food preference13</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">Extends lifespan on NGM31</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="3">Antibiotics</td>
			<td rowspan="3">Antibiotics (kanamycin, carbenicillin, etc.)</td>
			<td colspan="2" rowspan="3">Yes</td>
			<td rowspan="3">Yes</td>
			<td colspan="4">Delays growth and development15</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">Extends lifespan in liquid media19</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">Extends lifespan on NGM15</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="3">PFA</td>
			<td rowspan="3">0.5% Paraformaldehyde</td>
			<td colspan="2" rowspan="3">Yes</td>
			<td rowspan="3">Yes</td>
			<td colspan="4">Small brood size decrease16</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">Small development time increase16</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">Decreased food preference16</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Table 1. Comparisons of methods to kill OP50. UV-killing, heat-killing, antibiotic-treatment, and PFA-treatment have varied effects on the nutritional status of the bacteria and the health of worms fed treated bacteria. These methods for replicatively inactivating E. coli also differ in their required materials and scalability.

Autor im Rampenlicht: Förderung der Caenorhabditis elegans-Forschung mit Paraformaldehyd-behandelten Bakterien 

Methodik zur metabolischen Inaktivierung von Bakterien für die Caenorhabditis elegans-Forschung

A challenge in sea elegance research is isolating the effects of a live bacterial diet from the effects of experimental manipulations. It can be difficult to determine whether the manipulation directly impacts the host or indirectly impacts the worms through a host microbiome interactions. Paraformaldehyde treated bacteria address the challenge of isolating the effects of bacterial metabolism from host physiology.Paraformaldehyde treatment is high throughput and consistently renders the bacteria replicate and metabolically inactive. In addition to its consistency PFA treated bacteria remain a palatable and nutritious food source.

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Bacterial Inoculation and Paraformaldehyde Inactivation for  Caenorhabditis elegans  Research  

Bakterielle Inokulation und Paraformaldehyd-Inaktivierung für die Caenorhabditis elegans-Forschung

Beginnen Sie damit, eine einzelne Bakterienkolonie in 200 Milliliter sterilisierte Luria-Bouillon in einem 500-Milliliter-Erlenmeyerkolben zu impfen. Kultivieren Sie die Bakterien über Nacht in einem bei 37 Grad eingestellten Shaker-Inkubator. Überprüfen Sie nach 14 Stunden Kultur die optische Dichte der Bakterien bei 600 Nanometern.Aliquotieren Sie die Bakterien in konische 50-Milliliter-Röhrchen und lagern Sie sie zur weiteren Verwendung bei vier Grad Celsius. Mit einer serologischen Pipette werden 50 Milliliter der Bakterienkultur in einen neuen 250-Milliliter-Erlenmeyerkolben überführt. Verwenden Sie eine serologische Pipette, um 50 Milliliter der Bakterien in ein konisches 50-Milliliter-Röhrchen zu übertragen, um die simulierte Kontrolle vor dem Waschen durchzuführen.Geben Sie in der Chemikalienhaube 781 Mikroliter Paraformaldehyd in die Bakterienkultur, um eine Endkonzentration von 0,5 % zu erreichen. Entsorgen Sie die gebrauchte Spitze in einem Behälter für chemische Gefahren aus festen Abfällen. Decken Sie den Kolben anschließend mit einem Blatt Folie ab und legen Sie ihn für eine Stunde bei 37 Grad Celsius in einen Schüttel-Inkubator. Sobald die Inkubation abgeschlossen ist, waschen Sie die Bakterien, um alle Paraformaldehyd-Reste zu entfernen.Zur Entfernung des Restparaformaldehyds werden die behandelten Bakterien mit einer serologischen Pipette aus dem Erlenmeyerkolben in ein konisches 50-Milliliter-Röhrchen überführt. Anschließend zentrifugieren Sie die behandelten Bakterien bei ca. 3000 g für 20 Minuten. Entsorgen Sie den Überstand in einem Behälter für flüssige chemische Abfälle in der Chemikalienhaube.Geben Sie nun 25 Milliliter der Luria-Brühe in die behandelten und kontrollierenden Bakterienpellets und wirbeln Sie die Bakterienpellets auf. Wiederholen Sie die Zentrifugation und die Resuspension der Pellets viermal. Zur Vorbereitung auf verschiedene Assays wird das Pellet in geeigneten Volumina resuspendiert.Für Lifespan-Assays. Säen Sie 200 Mikroliter Bakterien, die in 10 Millilitern Luria-Brühe resuspendiert wurden, auf 60-Millimeter-Platten. Lagern Sie die Bakterien bei vier Grad Celsius.Um eine Qualitätskontrolle des Bakterienwachstums durchzuführen, streichen Sie eine Luria-Bouillonplatte mit einem vorbereiteten Bakterium mit einer sterilen Pipettenspitze ab. Um die Kontamination zu überprüfen, steak Sie die Luria-Brühe, die zum Waschen und Resuspendieren verwendet wurde, auf einem separaten Teller. Als nächstes legen Sie die Platten über Nacht in einen 37 Grad Celsius warmen Inkubator.Prüfen Sie am nächsten Tag auf Bakterienwachstum. Bewahren Sie die Bakterien auf, wenn die Paraform-Aldehyd-Präparation erfolgreich ist und die Kolonien auf der LB-Platte nicht wachsen. Um die bakterielle Stoffwechselaktivität mit einem Respirometer zu überprüfen, hydratisieren Sie zunächst die Kartusche, indem Sie 200 Mikroliter Kalibrant in alle Vertiefungen auf einer 96-Well-Platte geben.Legen Sie die Kartusche in die 96-Well-Platte und inkubieren Sie sie über Nacht bei 37 Grad Celsius. Stellen Sie das Gerät auf Mischen, Wiegen, Messen und Schleifen ein. Legen Sie am nächsten Tag die hydratisierte Kartusche in die Maschine.Zu einer neuen 96-Well-Platte geben Sie 160 Mikroliter M9 in die Testvertiefungen, gefolgt von 40 Mikrolitern vorbereiteter Bakterien. Geben Sie 200 Mikroliter M9 in die vier Eckvertiefungen, um als Leerlöcher zu fungieren. Geben Sie 160 Mikroliter M9 und 40 Mikroliter Luria-Brühe als Negativkontrollen ab.Zum Schluss pipettieren Sie 200 Mikroliter M9 in die verbleibenden unbenutzten Vertiefungen. Ersetzen Sie dann die ausgeworfene Kalibrierplatte durch die Assay-Platte, bevor Sie das Programm ausführen. Die Ergebnisse werden als Sauerstoffverbrauch angezeigt.Verschiedene Stämme zeigten unterschiedliche Inaktivierungsreaktionszeiten auf Paraformaldehyd. Zum Beispiel reicht eine einstündige Exposition von HB101-Bakterien gegenüber 0,25 % aus, um sie metabolisch inaktiv zu machen. Enterococcus faecalis benötigte eine Konzentration von 1,0 % für eine konsistente Wirkung.Caenorhabditis elegans-Würmer zeigten ähnliche Präferenzen gegenüber den behandelten OP 50-Stämmen wie auch gegenüber der simulierten Kontrolle. Ein sensitiver paarweiser Assay zeigte jedoch eine stärkere Präferenz für die simulierte Kontrolle. Würmer auf behandeltem OP 50 haben eine höhere Pumprate als Würmer auf der simulierten Kontrolle.Der Verzehr von behandelten Bakterien führte zu einer verzögerten Entwicklungszeit bei Wildtyp-Würmern sowie zu einer verminderten Eiablagekapazität. Die Lebensdauer der Würmer unterschied sich nicht signifikant voneinander, unabhängig von der Nahrungsquelle. Die mit Paraformaldehyd behandelten Bakterien verlängerten jedoch die Lebensdauer der Würmer in Gegenwart von 5-Fluor-2'desoxyuridin. Der Verzehr der mit Paraformaldehyd behandelten Bakterien durch einen langlebigen Wurmstamm veränderte ihre Langlebigkeit nicht.

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Research

JoVE Journal

Biology

Bacterial Inoculation and Paraformaldehyde Inactivation for Caenorhabditis elegans Research

110 Views.  University of Michigan, Ann Arbor. Begin by inoculating a single bacterial colony into 200 milliliters of sterilized Luria broth in a 500-milliliter Erlenmeyer flask. Culture the bacteria overnight in a shaker incubator set at 37 degrees. After 14 hours of culture, check the optical density of the bacteria at 600 nanometers.Aliquot the bacteria into 50-milliliter conical tubes and store them at four degrees Celsius for further use. Using a serological pipette, transfer 50 milliliters of the bacterial culture into a new ...