bacterial inoculation and paraformaldehyde inactivation for caenorhabditis elegans research

Inativação Metabólica Bacteriana em Caenorhabditis elegans Usando Paraformaldeído

Caenorhabditis elegans was originally proposed as a model organism in 19651 and has since been widely adopted in studies of genetics, development, behavior, aging, and metabolism2. Due to their large brood size and transparent cuticle, C. elegans is particularly well-suited for high-throughput screening with fluorescent reporters3. Their short life cycle, hermaphroditic reproduction, and genetic homology with humans also make C. elegans a valuable model system for studies on development4 and aging biology5. Moreover, C. elegans are relatively easy to maintain. Worms can be grown in liquid culture or on solid agar plates and consume a diet of live Escherichia coli OP50 bacteria4.
However, the live food source of C. elegans can confound studies of metabolism, drug supplementation, and behavior. Because live bacteria have their own metabolism, experimental conditions that affect the bacteria also alter the nutrients and metabolites available to the worms. For example, differences in bacterial iron, amino acid, and folate concentrations have diverse effects on C. elegans&#39; development, physiology, and lifespan6. Many common lab practices can elicit such changes in the nutrient composition and metabolites produced by OP50. Specifically, exposure to 5-fluoro-2&#39;-deoxyuridine (FUdR), a compound commonly used to prevent reproduction in C. elegans, elicits broad changes in OP50 gene expression, including amino acid biosynthesis pathways7. Live bacteria can also confound studies in which C. elegans are supplemented with small molecules because bacteria can partially or completely metabolize the active compounds. Moreover, the effects of these small molecules on the bacteria can, in turn, alter C. elegans physiology, as was reported with the lifespan-extending drug metformin8. Finally, live bacteria can change the worm&#39;s environment in ways that alter behavior, such as secreting attractive odorants9, producing exogenous neuromodulators10, and creating oxygen gradients in a dense bacteria lawn11.
To mitigate the confounding effects of bacterial metabolism on C. elegans research, multiple methods for killing bacteria have been developed (Table 1). Three common strategies for killing OP50 are UV-irradiation, heat-killing, and antibiotic treatment. While straightforward and relatively low-cost, each of these methods can have undesirable effects on both bacteria and C. elegans. UV-killing via a UV crosslinker12 is low-throughput and the rate is limited by the number of plates that can fit in the UV crosslinker. Moreover, the efficacy of UV-killing can vary from plate to plate within a batch, and testing for growth on all plates can become difficult in large experiments. Heat-killing OP50 by exposing culture to temperatures of &#62;60 &#176;C comes with a separate set of challenges. High heat can damage nutrients essential for the worm and destroy the cellular structure of bacteria, creating a softer texture that decreases the amount of time worms spend on the food13. This method also cannot be used throughout the life cycle of C. elegans because worms fed heat-killed bacteria can arrest early in development13. Antibiotic treatment is a third common method for suppressing bacterial metabolism14, but antibiotics can also alter worm growth and metabolism15.
One solution to eliminate the metabolic effects of live bacteria while preserving bacterial structure and essential nutrients is to kill OP50 with paraformaldehyde (PFA)16. PFA is a polymer of formaldehyde that can crosslink proteins within cells17 to prevent bacterial replication without destroying internal cell structures like the inner plasma membrane18. Due to this preservation of internal cellular structure, PFA-treated bacteria exhibit no growth or metabolic activity but remain an edible and nutrient-rich food source for C. elegans16. Here, a detailed protocol is provided which shows how to metabolically inactivate bacteria using paraformaldehyde.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Method</td>
			<td>Required Materials</td>
			<td colspan="2">Scalable?</td>
			<td>Nutritional?</td>
			<td colspan="4">Effects on Worm?</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="4">UV</td>
			<td rowspan="4">UV-crosslinker</td>
			<td colspan="2">Limited by:</td>
			<td rowspan="4">Yes</td>
			<td colspan="4">Variable effects on lifespan on NGM12, 23, 24</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">Number of plates that fit in UV-crosslinker</td>
			<td colspan="4">Variable effects on lifespan on FUdR24, 26, 27</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">Irradiation time per plate</td>
			<td colspan="4" rowspan="2">Decreased food preference16</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">Ability to check every plate for growth8</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="3">Heat</td>
			<td rowspan="3">&#62;60 &#176;C incubator</td>
			<td colspan="2" rowspan="3">Yes</td>
			<td rowspan="3">No: destroys cell wall, decreased nutritional value</td>
			<td colspan="4">Developmental arrest 13</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">Decreased food preference13</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">Extends lifespan on NGM31</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="3">Antibiotics</td>
			<td rowspan="3">Antibiotics (kanamycin, carbenicillin, etc.)</td>
			<td colspan="2" rowspan="3">Yes</td>
			<td rowspan="3">Yes</td>
			<td colspan="4">Delays growth and development15</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">Extends lifespan in liquid media19</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">Extends lifespan on NGM15</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="3">PFA</td>
			<td rowspan="3">0.5% Paraformaldehyde</td>
			<td colspan="2" rowspan="3">Yes</td>
			<td rowspan="3">Yes</td>
			<td colspan="4">Small brood size decrease16</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">Small development time increase16</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">Decreased food preference16</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Table 1. Comparisons of methods to kill OP50. UV-killing, heat-killing, antibiotic-treatment, and PFA-treatment have varied effects on the nutritional status of the bacteria and the health of worms fed treated bacteria. These methods for replicatively inactivating E. coli also differ in their required materials and scalability.

Autor em destaque: Avançando na pesquisa de Caenorhabditis elegans usando bactérias tratadas com paraformaldeído 

Metodologia para Inativação Metabolicamente de Bactérias para Pesquisa de Caenorhabditis elegans

A challenge in sea elegance research is isolating the effects of a live bacterial diet from the effects of experimental manipulations. It can be difficult to determine whether the manipulation directly impacts the host or indirectly impacts the worms through a host microbiome interactions. Paraformaldehyde treated bacteria address the challenge of isolating the effects of bacterial metabolism from host physiology.Paraformaldehyde treatment is high throughput and consistently renders the bacteria replicate and metabolically inactive. In addition to its consistency PFA treated bacteria remain a palatable and nutritious food source.

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Bacterial Inoculation and Paraformaldehyde Inactivation for  Caenorhabditis elegans  Research  

Inoculação bacteriana e inativação de paraformaldeído para pesquisa de Caenorhabditis elegans

Comece inoculando uma única colônia bacteriana em 200 mililitros de caldo Luria esterilizado em um frasco Erlenmeyer de 500 mililitros. Cultive as bactérias durante a noite em uma incubadora de agitadores a 37 graus. Após 14 horas de cultivo, verificar a densidade óptica das bactérias a 600 nanômetros.Aliquot as bactérias em tubos cônicos de 50 mililitros e armazená-los a quatro graus Celsius para uso posterior. Usando uma pipeta sorológica, transfira 50 mililitros da cultura bacteriana para um novo frasco de Erlenmeyer de 250 mililitros rotulado para controle vivo ou simulado. Use uma pipeta sorológica para transferir 50 mililitros da bactéria para um tubo cônico de 50 mililitros para o controle simulado antes da lavagem.Na coifa química, adicione 781 microlitros de paraformaldeído à cultura bacteriana para atingir uma concentração final de 0,5%Descarte a ponta usada em um recipiente de risco químico de resíduos sólidos. Em seguida, cubra o balão com uma folha de papel alumínio e coloque-o em uma incubadora a 37 graus Celsius por uma hora. Quando a incubação estiver completa, lave as bactérias para remover qualquer paraformaldeído residual.Para a remoção do paraformaldeído residual, utilizando uma pipeta sorológica, transferir as bactérias tratadas do frasco de Erlenmeyer para um tubo cônico de 50 mililitros. Em seguida, centrifugar as bactérias tratadas a aproximadamente 3000 G por 20 minutos. Descarte o sobrenadante em um recipiente de risco químico de resíduos líquidos dentro da coifa química.Agora adicione 25 mililitros do caldo Luria aos pellets bacterianos tratados e de controle, e vortex para ressuspender os pellets bacterianos. Repita a centrifugação e a ressuspensão do pellet quatro vezes. Em preparação para vários ensaios, ressuspenda o pellet em volumes adequados.Para ensaios de vida útil. Seme 200 microlitros de bactérias ressuspendidos em 10 mililitros de caldo Luria em placas de 60 milímetros. Armazenar as bactérias a quatro graus Celsius.Para realizar uma verificação de qualidade do crescimento bacteriano, passe uma placa de caldo Luria com uma bactéria preparada usando uma ponta de pipeta estéril. Para verificar a contaminação, bife o caldo Luria usado para lavar e ressuspender em um prato separado. Em seguida, coloque as placas em uma incubadora de 37 graus Celsius durante a noite.No dia seguinte, verifique se há algum crescimento bacteriano. Salve as bactérias se a preparação de aldeídos paraformes for bem-sucedida e as colônias não crescerem na placa LB. Para verificar a atividade metabólica bacteriana com um respirômetro, primeiro hidrate o cartucho adicionando 200 microlitros de calibrador a todos os poços em uma placa de 96 poços.Coloque o cartucho na placa de 96 poços e incube durante a noite a 37 graus Celsius. Configure a máquina para misturar, pesar, medir e fazer loop. No dia seguinte, coloque o cartucho hidratado na máquina.Para uma nova placa de 96 poços, adicione 160 microlitros de M9 aos poços de teste, seguidos por 40 microlitros de bactérias preparadas. Adicione 200 microlitros de M9 nos quatro poços de canto para agir como brancos. Dispensar 160 microlitros de M9 e 40 microlitros de caldo Luria como controles negativos.Finalmente, pipetar 200 microlitros de M9 para os poços restantes não utilizados. Em seguida, substitua a placa de calibração ejetada pela placa de ensaio antes de executar o programa. Os resultados serão exibidos como a taxa de consumo de oxigênio.Diferentes cepas exibiram diferentes tempos de resposta de inativação ao paraformaldeído. Por exemplo, a exposição da bactéria HB101 a 0,25% por uma hora é suficiente para torná-la metabolicamente inativa. Enterococcus faecalis necessitou de uma concentração de 1,0% para um efeito consistente.Os vermes Caenorhabditis elegans exibiram preferências semelhantes em relação às cepas OP 50 tratadas, bem como ao controle tratado simuladamente. No entanto, um ensaio pareado sensível revelou uma preferência mais forte pelo controle tratado simulado. Vermes no OP 50 tratado têm uma taxa de bombeamento mais alta do que os vermes no controle tratado simulado.O consumo de bactérias tratadas resultou em atraso no tempo de desenvolvimento de vermes selvagens, bem como em menor capacidade de postura de ovos. O tempo de vida dos vermes não foi significativamente diferente entre si, independentemente da fonte de alimento. No entanto, as bactérias tratadas com paraformaldeído aumentaram a vida útil do verme na presença de 5-Fluoro-2'desoxiuridina O consumo das bactérias tratadas com paraformaldeído por uma cepa de verme de vida longa não alterou sua longevidade.

Research

JoVE Journal

Biology

Bacterial Inoculation and Paraformaldehyde Inactivation for Caenorhabditis elegans Research

Methodology to Metabolically Inactivate Bacteria for Caenorhabditis elegans Research

Caenorhabditis elegans is a common model organism for research in genetics, development, aging, metabolism, and behavior. Because C. elegans consume a ...