bacterial inoculation and paraformaldehyde inactivation for caenorhabditis elegans research

Paraformaldehit Kullanılarak Caenorhabditis elegans'ta Bakteriyel Metabolik İnaktivasyon

Caenorhabditis elegans was originally proposed as a model organism in 19651 and has since been widely adopted in studies of genetics, development, behavior, aging, and metabolism2. Due to their large brood size and transparent cuticle, C. elegans is particularly well-suited for high-throughput screening with fluorescent reporters3. Their short life cycle, hermaphroditic reproduction, and genetic homology with humans also make C. elegans a valuable model system for studies on development4 and aging biology5. Moreover, C. elegans are relatively easy to maintain. Worms can be grown in liquid culture or on solid agar plates and consume a diet of live Escherichia coli OP50 bacteria4.
However, the live food source of C. elegans can confound studies of metabolism, drug supplementation, and behavior. Because live bacteria have their own metabolism, experimental conditions that affect the bacteria also alter the nutrients and metabolites available to the worms. For example, differences in bacterial iron, amino acid, and folate concentrations have diverse effects on C. elegans&#39; development, physiology, and lifespan6. Many common lab practices can elicit such changes in the nutrient composition and metabolites produced by OP50. Specifically, exposure to 5-fluoro-2&#39;-deoxyuridine (FUdR), a compound commonly used to prevent reproduction in C. elegans, elicits broad changes in OP50 gene expression, including amino acid biosynthesis pathways7. Live bacteria can also confound studies in which C. elegans are supplemented with small molecules because bacteria can partially or completely metabolize the active compounds. Moreover, the effects of these small molecules on the bacteria can, in turn, alter C. elegans physiology, as was reported with the lifespan-extending drug metformin8. Finally, live bacteria can change the worm&#39;s environment in ways that alter behavior, such as secreting attractive odorants9, producing exogenous neuromodulators10, and creating oxygen gradients in a dense bacteria lawn11.
To mitigate the confounding effects of bacterial metabolism on C. elegans research, multiple methods for killing bacteria have been developed (Table 1). Three common strategies for killing OP50 are UV-irradiation, heat-killing, and antibiotic treatment. While straightforward and relatively low-cost, each of these methods can have undesirable effects on both bacteria and C. elegans. UV-killing via a UV crosslinker12 is low-throughput and the rate is limited by the number of plates that can fit in the UV crosslinker. Moreover, the efficacy of UV-killing can vary from plate to plate within a batch, and testing for growth on all plates can become difficult in large experiments. Heat-killing OP50 by exposing culture to temperatures of &#62;60 &#176;C comes with a separate set of challenges. High heat can damage nutrients essential for the worm and destroy the cellular structure of bacteria, creating a softer texture that decreases the amount of time worms spend on the food13. This method also cannot be used throughout the life cycle of C. elegans because worms fed heat-killed bacteria can arrest early in development13. Antibiotic treatment is a third common method for suppressing bacterial metabolism14, but antibiotics can also alter worm growth and metabolism15.
One solution to eliminate the metabolic effects of live bacteria while preserving bacterial structure and essential nutrients is to kill OP50 with paraformaldehyde (PFA)16. PFA is a polymer of formaldehyde that can crosslink proteins within cells17 to prevent bacterial replication without destroying internal cell structures like the inner plasma membrane18. Due to this preservation of internal cellular structure, PFA-treated bacteria exhibit no growth or metabolic activity but remain an edible and nutrient-rich food source for C. elegans16. Here, a detailed protocol is provided which shows how to metabolically inactivate bacteria using paraformaldehyde.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Method</td>
			<td>Required Materials</td>
			<td colspan="2">Scalable?</td>
			<td>Nutritional?</td>
			<td colspan="4">Effects on Worm?</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="4">UV</td>
			<td rowspan="4">UV-crosslinker</td>
			<td colspan="2">Limited by:</td>
			<td rowspan="4">Yes</td>
			<td colspan="4">Variable effects on lifespan on NGM12, 23, 24</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">Number of plates that fit in UV-crosslinker</td>
			<td colspan="4">Variable effects on lifespan on FUdR24, 26, 27</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">Irradiation time per plate</td>
			<td colspan="4" rowspan="2">Decreased food preference16</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">Ability to check every plate for growth8</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="3">Heat</td>
			<td rowspan="3">&#62;60 &#176;C incubator</td>
			<td colspan="2" rowspan="3">Yes</td>
			<td rowspan="3">No: destroys cell wall, decreased nutritional value</td>
			<td colspan="4">Developmental arrest 13</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">Decreased food preference13</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">Extends lifespan on NGM31</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="3">Antibiotics</td>
			<td rowspan="3">Antibiotics (kanamycin, carbenicillin, etc.)</td>
			<td colspan="2" rowspan="3">Yes</td>
			<td rowspan="3">Yes</td>
			<td colspan="4">Delays growth and development15</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">Extends lifespan in liquid media19</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">Extends lifespan on NGM15</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="3">PFA</td>
			<td rowspan="3">0.5% Paraformaldehyde</td>
			<td colspan="2" rowspan="3">Yes</td>
			<td rowspan="3">Yes</td>
			<td colspan="4">Small brood size decrease16</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">Small development time increase16</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">Decreased food preference16</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Table 1. Comparisons of methods to kill OP50. UV-killing, heat-killing, antibiotic-treatment, and PFA-treatment have varied effects on the nutritional status of the bacteria and the health of worms fed treated bacteria. These methods for replicatively inactivating E. coli also differ in their required materials and scalability.

Yazar Spotlight: Paraformaldehitle Tedavi Edilmiş Bakterileri Kullanarak Caenorhabditis elegans Araştırmasını İlerletmek 

Caenorhabditis elegans Araştırmaları için Bakterileri Metabolik Olarak İnaktive Etme Metodolojisi

A challenge in sea elegance research is isolating the effects of a live bacterial diet from the effects of experimental manipulations. It can be difficult to determine whether the manipulation directly impacts the host or indirectly impacts the worms through a host microbiome interactions. Paraformaldehyde treated bacteria address the challenge of isolating the effects of bacterial metabolism from host physiology.Paraformaldehyde treatment is high throughput and consistently renders the bacteria replicate and metabolically inactive. In addition to its consistency PFA treated bacteria remain a palatable and nutritious food source.

Watch this Scientific Journal Video about Bacterial Inoculation and Paraformaldehyde Inactivation for  Caenorhabditis elegans  Research at JoVE.com

Bacterial Inoculation and Paraformaldehyde Inactivation for  Caenorhabditis elegans  Research  

Caenorhabditis elegans Araştırmaları için Bakteriyel Aşılama ve Paraformaldehit İnaktivasyonu

Tek bir bakteri kolonisini 500 mililitrelik bir Erlenmeyer şişesinde 200 mililitre sterilize edilmiş Luria suyuna aşılayarak başlayın. Bakterileri gece boyunca 37 dereceye ayarlanmış bir çalkalayıcı inkübatörde kültürleyin. 14 saatlik kültürden sonra, bakterilerin optik yoğunluğunu 600 nanometrede kontrol edin.Bakterileri 50 mililitrelik konik tüplere koyun ve daha sonra kullanmak üzere dört santigrat derecede saklayın. Serolojik bir pipet kullanarak, 50 mililitre bakteri kültürünü yeni bir 250 mililitrelik Erlenmeyer şişesine aktarın Canlı veya sahte işlem görmüş kontrol için tüpleri etiketleyin. Yıkamadan önce sahte işlem görmüş kontrol için 50 mililitre bakteriyi 50 mililitrelik konik bir tüpe aktarmak için serolojik bir pipet kullanın.Kimyasal davlumbazda, %0,5'lik bir nihai konsantrasyon elde etmek için bakteri kültürüne 781 mikrolitre paraformaldehit ekleyinKullanılmış ucu katı atık kimyasal tehlike kabına atın. Daha sonra, şişeyi bir folyo tabakasıyla örtün ve bir saat boyunca 37 santigrat derecede bir çalkalayıcı inkübatöre yerleştirin. İnkübasyon tamamlandıktan sonra, kalan paraformaldehiti çıkarmak için bakterileri yıkayın.Kalıntı paraformaldehitin çıkarılması için, serolojik bir pipet kullanarak, muamele edilen bakterileri Erlenmeyer şişesinden 50 mililitrelik konik bir tüpe aktarın. Daha sonra, tedavi edilen bakterileri 20 dakika boyunca yaklaşık 3000 G'de santrifüjleyin. Süpernatanı, kimyasal davlumbazın içindeki bir sıvı atık kimyasal tehlike kabına atın.Şimdi işlenmiş ve kontrol edilen bakteri peletlerine 25 mililitre Luria suyu ekleyin ve bakteri peletlerini yeniden süspanse etmek için girdap yapın. Santrifüjleme ve pelet yeniden süspansiyonunu dört kez tekrarlayın. Çeşitli tahlillere hazırlanırken, peleti uygun hacimlerde yeniden süspanse edin.Ömür taylileri için. 10 mililitre Luria suyunda 60 milimetrelik plakalara yeniden süspanse edilen 200 mikrolitre bakteri tohumu. Bakterileri dört santigrat derecede saklayın.Bakteri üremesinin kalite kontrolünü yapmak için, steril bir pipet ucu kullanarak hazırlanmış bir bakteri içeren bir Luria et suyu tabağı çizin. Kontaminasyonu doğrulamak için, yıkamak ve yeniden süspanse etmek için kullanılan Luria suyunu ayrı bir tabakta bifteğin. Daha sonra plakaları gece boyunca 37 santigrat derecelik bir inkübatöre yerleştirin.Ertesi gün, herhangi bir bakteri üremesi olup olmadığını kontrol edin. Paraform aldehit preparatı başarılı olursa ve koloniler LB plakasında büyüyemezse bakterileri kurtarın. Bakteriyel metabolik aktiviteyi bir respirometre ile kontrol etmek için, önce 96 oyuklu bir plaka üzerindeki tüm kuyucuklara 200 mikrolitre kalibrant ekleyerek kartuşu nemlendirin.Kartuşu 96 oyuklu plakaya yerleştirin ve gece boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin. Makineyi karıştırmak, ağırlıklandırmak, ölçmek ve döngüye almak için ayarlayın. Ertesi gün, hidratlı kartuşu makineye yerleştirin.Yeni bir 96 oyuklu plakaya, test kuyucuklarına 160 mikrolitre M9, ardından 40 mikrolitre hazırlanmış bakteri ekleyin. Boşluk görevi görmesi için dört köşe kuyucuğuna 200 mikrolitre M9 ekleyin. Negatif kontroller olarak 160 mikrolitre M9 ve 40 mikrolitre Luria suyu dağıtın.Son olarak, kalan kullanılmayan kuyucuklara 200 mikrolitre M9 pipetleyin. Ardından, programı çalıştırmadan önce çıkarılan kalibrasyon plakasını tahlil plakasıyla değiştirin. Sonuçlar oksijen tüketim oranı olarak görüntülenecektir.Farklı suşlar, paraformaldehite farklı inaktivasyon yanıt süreleri sergiledi. Örneğin, HB101 bakterisinin bir saat boyunca% 0.25'e maruz kalması, metabolik olarak inaktif hale getirmek için yeterlidir. Enterococcus faecalis, tutarlı etki için% 1.0 konsantrasyon gerektirdi.Caenorhabditis elegans solucanları, tedavi edilen OP 50 suşlarının yanı sıra sahte muamele edilen kontrole karşı benzer tercihler sergiledi. Bununla birlikte, hassas bir ikili tahlil, sahte muamele edilen kontrol için daha güçlü bir tercih ortaya çıkardı. Arıtılmış OP 50 üzerindeki solucanlar, sahte işlem görmüş kontroldeki solucanlardan daha yüksek bir pompalama hızına sahiptir.Tedavi edilen bakterilerin tüketimi, yabani tip solucanlarda gelişme süresinin gecikmesine ve yumurtlama kapasitesinin düşmesine neden oldu. Solucanların ömrü, besin kaynağından bağımsız olarak birbirinden önemli ölçüde farklı değildi. Bununla birlikte, paraformaldehit ile muamele edilmiş bakteriler, 5-Floro-2'deoksiüridin varlığında solucan ömrünü uzatmıştır Paraformaldehit ile muamele edilmiş bakterilerin uzun ömürlü bir solucan suşu tarafından tüketilmesi, ömrünü değiştirmemiştir.

Research

JoVE Journal

Biology

Bacterial Inoculation and Paraformaldehyde Inactivation for Caenorhabditis elegans Research

Methodology to Metabolically Inactivate Bacteria for Caenorhabditis elegans Research

Caenorhabditis elegans is a common model organism for research in genetics, development, aging, metabolism, and behavior. Because C. elegans consume a ...