Para processar as imagens dos neurônios corados fluorescentemente adquiridas usando um microscópio de fluorescência confocal use o software de ligação de fenol para segmentação de imagens e extração de características. No software carregue a placa de escolha para acessar os dados e selecione a imagem desejada. Para realizar a segmentação da imagem nas imagens brutas corrigidas pela iluminação, ajuste as intensidades fluorescentes para visualizar os diferentes canais.
Determinar empiricamente os respectivos limiares de intensidade de canal por placa para garantir que o sinal segmentado desejado corresponda ao sinal na imagem bruta e minimizar o sinal de fundo. Para separar as células vivas das mortas, defina o tamanho do núcleo e os limiares de intensidade. Meça o tamanho do núcleo clicando duas vezes e visualize a intensidade exibida.
Ao usar imagens de 40 X, mantenha os parâmetros padrão e execute o processamento. Com os dados quantitativos tabulares resultantes, construa perfis fenotípicos para comparar diferentes linhagens celulares ou condições de tratamento. Executar o notebook Jupyter célula por célula, utilizando o software Jupyter para geração e visualização do perfil fenotípico.
As imagens foram segmentadas e as características fenotípicas extraídas. Um total de 126 características quantitativas que poderiam ser agregadas em perfis fenotípicos bem fundamentados foram determinados. Algumas características apresentaram alterações com o tratamento composto.
Por exemplo, a intensidade de fluorescência da alfa-sinucleína em tirosina hidroxilase, ou células TH positivas, diminuiu após o tratamento com o inibidor de quinase LARK2 PFE-360. Outras características, como o comprimento da rede de neuritos MAP2 ou a proporção de neurônios positivos para HT, apresentaram diferenças apenas entre as linhagens celulares testadas, mas não no tratamento composto.