Para comenzar, abra una imagen de pila Z multicanal en Fiji y abra el archivo de script de análisis de biosensor deseado. Haga clic en Ejecutar en la ventana del editor de scripts para ejecutar el script. A continuación, introduzca la información solicitada en la ventana de diálogo que aparece.
Seleccione los números de canal del numerador y el denominador para el cálculo de la relación. En el caso de las mitocondrias dirigidas a HyPer7, el numerador es el canal excitado a 488 nanómetros y el denominador es el canal excitado a 405 nanómetros. Seleccione el número de canal de la imagen de luz transmitida si está presente, o cero si no hay ninguno.
A continuación, elija el método de sustracción de fondo deseado. Si el fondo es uniforme, haga clic en seleccionar un área de imagen para medir el nivel de fondo de la imagen. Luego, elija el método de sustracción de ruido deseado para reducir la variación aleatoria en la lectura del detector.
Haga clic en Seleccionar un área de imagen. Seleccione la opción de valor fijo para introducir un nivel de ruido medido previamente, que suele funcionar bien si las condiciones de imagen se mantienen constantes. Para una detección precisa y coherente de las mitocondrias, seleccione un algoritmo de umbral como Otsu o Máxima entropía.
Utilice el mismo algoritmo para todas las imágenes de un experimento, pero asegúrese de que las mitocondrias se reconozcan con precisión. A continuación, seleccione el número de regiones de interés por celda. Por ejemplo, si mide las diferencias de las yemas madre, seleccione dos.
Seleccione la carpeta de salida donde se guardarán las mediciones y las imágenes de proporción. Para la corrección de fondo o ruido, seleccione Seleccionar un área de imagen. Siga las indicaciones para dibujar un área de fondo con la herramienta ROI rectangular y haga clic en Aceptar.
Al analizar células individuales o regiones subcelulares, dibuje regiones de interés en función de la imagen de campo claro. No es necesario que el ROI coincida con precisión con el contorno de la célula, ya que solo se medirán las mitocondrias con umbral dentro del ROI. Después de crear cada ROI, presione T para agregar el ROI seleccionado al Administrador de ROI.
Marque Mostrar todo en el Administrador de ROI para documentar las celdas marcadas. Cada región agregada aparecerá como un elemento numerado en la lista del Administrador de ROI. Si analiza más de un ROI por celda, marque los ROI en el mismo orden para cada celda analizada.
Una vez que se hayan agregado todos los ROI deseados al administrador de ROI, haga clic en Aceptar en la ventana de diálogo Marcar celdas. A continuación, seleccione el formato de la tabla de medidas. En la ventana de diálogo Multicompase, marque las opciones de medir todos los sectores y una fila por sector para producir una tabla con el formato deseado.
Utilice las tablas de ROI múltiple de procesos. rscript para procesar las tablas creadas con la opción one-row-per-slice. No marque la opción anexar resultados.
Guarde los archivos de salida en la carpeta seleccionada utilizando el script. Ahora abra la imagen de la pila de proporción Z en Fiji para generar una imagen de proporción coloreada. A continuación, abra el colorize_ratio_image.
ijm y haga clic en Ejecutar en la ventana del editor de scripts. Aparecerá una ventana de diálogo en la que se le pedirá que introduzca la información solicitada. En la opción no modulada, todos los píxeles mitocondriales aparecen con el mismo brillo.
Algunas imágenes pueden parecer ruidosas, ya que los píxeles tenues y brillantes contribuyen a la proporción de la imagen. Utilice la opción de intensidad modulada para reducir el ruido. En el método de los valores mínimos y máximos mostrados, elija valores cercanos a los valores mínimos y máximos promedio observados en un experimento.
Para garantizar la coherencia, adquiera todas las imágenes utilizando las mismas condiciones de imagen y muestre todas las imágenes utilizando los mismos valores mínimos y máximos. A continuación, seleccione el modo de proyección para proyectar la pila Z y mostrar toda la población mitocondrial antes de la coloración. Para una proyección de intensidad máxima, seleccione máxima.
Para crear una proyección de intensidad media, seleccione media. Finalmente, seleccione la carpeta para guardar las imágenes coloreadas. Si se selecciona la opción sin modulación, elija un esquema de color en la ventana de diálogo que aparece.
Utilice las tablas de búsqueda RGB de fuego o arco iris integradas en Fiji o cualquier tabla de búsqueda deseada en el formato LUT de ImageJ. Utilice el script para guardar los archivos de salida en la carpeta seleccionada. La proporción reducida oxidada de mitocondrias marcadas con HyPer7 mostró una respuesta dependiente de la dosis a la concentración de peróxido de hidrógeno, que alcanzó una meseta en uno o dos milimolares de peróxido de hidrógeno añadido externamente.
Se observaron diferencias en el peróxido de hidrógeno mitocondrial dentro de las células de levadura. Se detectó una disminución estadísticamente significativa en la lectura del biosensor de peróxido de hidrógeno en las mitocondrias de la yema en comparación con la célula madre.
