Name: Using a Respiratory Chamber to Measure Metabolic Rate in Drosophila melanogaster
Uploaded: 2023-07-07T13:20:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Using a Respiratory Chamber to Measure Metabolic Rate in Drosophila melanogaster at JoVE.com

using a respiratory chamber to measure metabolic rate in drosophila melanogaster

Drosophila için Mikrorespirometrinin Uyarlanması - CASK Mutant Metabolizmasına İlişkin Görüşler

The ability to measure metabolic rate is crucial for a complete understanding of an organism in its environmental context. For example, it is necessary to measure metabolic rate in order to understand its role in lifespan1, the role of diet in metabolism2, or the threshold for hypoxic stress3.
There are two general approaches to measuring the metabolic rate4. Direct calorimetry measures energy expenditure directly by measuring heat production. Indirect calorimetry measures energy production through other means, often via respirometric measurement of O2 consumption (VO2), CO2 production or both. Although direct calorimetry has been applied to small ectotherms, including Drosophila melanogaster5, respirometry is technically simpler and more commonly used.
Several forms of respirometry have been used successfully to measure metabolic rate in wildtype and mutant D. melanogaster and have provided insight into the metabolic effects of temperature6, social environment3, diet3,7,and neurodevelopmental disorders8. These fall into two classes, which vary considerably in cost and complexity. Manometry is the simplest and least expensive9,10, in which flies are placed into a sealed chamber that contains a CO2 absorbent and which is connected via a thin capillary to a fluid reservoir. As O2 is consumed and CO2 absorbed, pressure in the chamber decreases and fluid is drawn into the capillary. The fluid-filled volume of the capillary is therefore proportional to VO2. More elaborate versions, which compensate for the force exerted by the fluid in the capillary, have also been used on D. melanogaster1. Manometry has the advantages of being simple and inexpensive, but, because it is sensitive to pressure, requires constant environmental conditions. Further, because consumed O2 is not replaced, the partial pressure of O2 (PO2) gradually decreases inside the chambers.
Respirometry using gas analysis is also regularly used for D. melanogaster. In this case, gases are sampled at regular intervals from sealed chambers containing flies and sent to an infrared analyzer2,6,11. This type of apparatus has the advantages that it is available commercially, is less sensitive to environmental conditions, and gases are refreshed during sampling so that PO2 remains stable. However, the equipment can be expensive and complex to operate.
A recently developed coulometric microrespirometer12 provides an inexpensive, sensitive, and stable alternative to existing systems. In practice, an organism is placed into an airtight chamber where it consumes O2 and the exhaled CO2 is removed by an absorbent material, resulting in a net decrease in chamber pressure. When the internal pressure decreases to a pre-set threshold (ON-threshold), current is passed through an electrolytic O2 generator, returning pressure to a second threshold (OFF-threshold) stopping electrolysis. Charge transfer across the O2 generator is directly proportional to the amount of O2 required to re-pressurize the chamber and can therefore be used to measure the O2 consumed by the organism4. The method is highly sensitive, measures VO2 precisely, and the regular replacement of O2 can maintain PO2 at a nearly constant level for hours or days.
The coulometric microrespirometer used in this study employs a multi-modal (pressure, temperature, and humidity) electronic sensor. The sensor is operated by a microcontroller that detects small changes in pressure and activates O2 generation when a low pressure threshold is reached12. This apparatus is assembled from off the shelf parts, can be used with a wide variety of chambers and experimental environments, and has been employed successfully to examine the effects of body mass and temperature on the beetle Tenebrio molitor. In the present study, the microrespirometer has been adapted to measure O2 consumption in D. melanogaster, which has approximately 1% of the mass of T. molitor. Sensitivity of the apparatus has been increased by reducing the threshold for activating O2 generation, and environmental stability has been enhanced by conducting experiments in a temperature-controlled water bath and by maintaining humidity inside the chambers at or near 100%.
The CASK (Calmodulin-dependent Serine Protein Kinase) protein, part of the family of membrane-associated guanylate kinases (MAGUK), is a molecular scaffold in different multi-protein complexes, and mutations in CASK are associated with neurodevelopmental disorders in humans and in D. melanogaster13,14. A viable D. melanogaster mutant, CASK&#916;18, disrupts activity of dopaminergic neurons15 and reduces activity levels by more than 50% compared to congenic controls14,16. Because of the reduced activity levels of CASK mutants and the role of catecholamines in regulating metabolism17 we hypothesized that their standard metabolic rate, and therefore O2 consumption, would be dramatically reduced compared to controls.
O2 consumption was measured in CASK&#916;18 and their wildtype congeners, w(ex33). Groups of flies were placed into respirometry chambers, O2 consumption was measured, O2 consumption was calculated and expressed on both a mass-specific and per-fly basis. The apparatus recorded VO2 in wildtype flies that was consistent with previous studies, and it could differentiate between the per-fly O2 consumption of wildtype and CASK mutant flies.

Yazar Spot Işığı: Sıcaklığın Drosophila melanogaster ve Çöle Adapte Böcekler Üzerindeki Etkisi 

Kulometrik Mikrorespirometri Kullanılarak Drosophila melanogaster'de O2 Tüketiminin Ölçülmesi

Our research is focused on how temperature and activity affect insect metabolism. This is essential to understand how species have evolved to survive in their surroundings, and how they will continue to adapt in a changing world. Understanding the physiology and behavior of individual organisms is crucial to this endeavor.Metabolic rate can be measured directly by measuring heat production, or indirectly by measuring the consumption of oxygen or the production of carbon dioxide. Although it is technically possible to measure heat production by an organism as small as a fruit fly, indirect methods are used more commonly. The current challenges to measuring metabolism on this scale will include cost, environmental stability, and reliability.Commercially available systems are reliable, stable, and relatively easy to purchase, but they can be complex and expensive. DIY manometers are inexpensive, but can introduce error and require fabrication for each experiment. The coulometric respirometer is relatively inexpensive, easy to use, provides a convenient readout of environmental parameters, and all components are reusable.In addition, the regular replacement of oxygen maintains a stable environment for hours or even days. In the lab, we'll be studying the metabolic variation between established control strains of drosophila, and the effects of hyper and hypoactive mutants on oxygen consumption. In the field, we'll begin studying the metabolic rates and temperature tolerance of wild, desert-adapted beetles.

Watch this Scientific Journal Video about Using a Respiratory Chamber to Measure Metabolic Rate in Drosophila melanogaster at JoVE.com

Using a Respiratory Chamber to Measure Metabolic Rate in Drosophila melanogaster  

Drosophila melanogaster'de Metabolik Hızı Ölçmek için Solunum Odası Kullanma

Sinekleri 25 santigrat derece sıcaklıkta, standart drosophila yemi ile doldurulmuş dar şişelerde tutarak başlayın. Su banyosunu açın ve sıcaklığı gerektiği gibi ayarlayın. Odaların ve sensör tapalarının buzlu cam bağlantılarını temizlemek için %70 etanol püskürtülmüş bir laboratuvar mendili kullanın ve ardından kalan etanolü çıkarmak için yeni bir mendil kullanın.Ardından, sabit, nemli bir ortam oluşturmak için odanın dibine arıtılmış suya batırılmış bir santimetrelik bir pamuk rulosu yerleştirin. Pamuk rulosunun tabanında mütevazı bir havuz oluşturmak için yeterli su ekleyin. Dökülen suyu silerek haznenin ek yerinin kuru olduğundan emin olun.Sinekleri bir huni kullanarak etiketli polipropilen tüplere dikkatlice aktarın ve tüpleri pamuklu bir rulo ile kapatın. Şimdi, her bir solunum ölçer odasına sinek içeren havalandırmalı bir tüp ekleyin. Soda kireç kartuşlarını doldurun ve haznenin içinde sinek bulunan tüpün üstüne yerleştirin.Ardından oksijen jeneratörlerini doymuş bir bakır sülfat çözeltisiyle doldurun ve seviyenin havalandırma deliklerinin altında kalmasını sağlayın. Dolu oksijen jeneratörünü sensör fişinde bulunan iki pimli konektöre bağlayın. Sensör tapasının buzlu cam bağlantısının karşı taraflarına iki küçük damla şeffaf silikon gres yerleştirin.Tapayı hazneye yerleştirin ve gresi bağlantı içinde eşit olarak dağıtmak için orta basınçla hafifçe döndürün. Bir laboratuvar bezi kullanarak fazla gresi silin. Ardından plastik keck kelepçelerini takarak hazne tapalarını sabitleyin.Monte edilmiş odaları, muslukların açık olduğundan emin olarak su banyosundaki bir rafa yerleştirin. Muslukları açık konumda tutun ve odaların yaklaşık 30 dakika dengelenmesine izin verin. Oksijen jeneratörlerine akım sağlayan anahtarların kapalı olduğundan emin olun.Altı iletken kabloyu kullanarak kontrolörleri respirometre odalarına bağlayın ve kontrolörlerdeki organik ışık yayan diyot ekranlarının aktif olarak çevresel parametreleri gösterdiğini doğrulayın. Şimdi kontrolördeki anahtarı kullanarak oksijen jeneratörlerini etkinleştirin. Akım değeri sıfırdan 35 ila 55 miliamper arasına yükseldiğinde, kontrolör ve oda deneyler için hazırdır.Oksijen jeneratörlerini kapattıktan sonra, kontrolörlerin kullandığı iletişim portlarını belirleyin. PuTTY yazılımını masa masaüstünde açın ve seri hat kutusuna o bağlantı noktasının numarasını girerek denetleyici için iletişim bağlantı noktasını seçerek solunum cihazının her kanalı için bir günlük dosyası oluşturun. Ardından günlüğe kaydetme'yi tıklayın.Oturum günlüğünde asıl çıktıyı seçin ve günlük dosyası adının altında Gözat'a tıklayın. Seçilen klasörde, açıklayıcı bilgiler içeren bir dosya adı oluşturun. Ardından kaydet'i tıklayın.Aç'a tıkladığınızda, günlüğe kaydedilen ortak sınırlandırılmış verileri gösteren bir pencere açılacaktır. Kullanılan diğer tüm denetleyiciler için bu işlemi tekrarlayın. Her iletişim portu girişi ayrı bir pencerede görüntülenecektir.Hazneleri 30 dakika dengeledikten sonra, vanaları kapatarak kapatın. Sabit bir ortam oluşturmak ve bir saat boyunca dengelemek için banyoyu ve odaları polistiren köpük kutu ile örtün. Kontrol kutusunda bulunan anahtarı kullanarak her odanın oksijen jeneratörüne giden akımı başlatın.Oksijen jeneratörleri etkinleştirildiğinde, basıncın önceden tanımlanmış kapalı basınca yükseldiğini doğrulayın. Deneyden sonra, tüm kontrolörlerdeki oksijen jeneratörlerini kapatın ve odaların mührünü açmak için vanaları açın. Son bir taban çizgisi oluşturmak için PuTTY pencerelerinin beş ila 15 dakika açık kalmasına izin verin ve ardından her denetleyici için PuTTY penceresini kapatarak kayıtları sonlandırın.Sensörleri kablolardan ayırın ve odaları kuru rafa taşıyın. Sensör tapalarını odalardan birer birer çıkarın. Oksijen jeneratörlerini ayırın ve dikkatlice tüp rafına yerleştirin.Ardından sensör tapasındaki gresi silin ve rafa geri yerleştirin. Hazne bağlantılarındaki gresi temizleyin ve sinek ve soda kireç içeren tüpleri çıkarın. Son olarak, her tüp için ağırlığı ve sinek sayısını kaydedin.Yabani tip ve fıçı delta 18 mutant sinekleri için kantitatif oksijen tüketimi verileri, kütleye özgü oksijen tüketiminin yabani tip kontroller ve fıçı delta 18 mutantları arasında önemli ölçüde farklı olmadığını göstermiştir. Sinek başına analiz edilen oksijen tüketimi, fıçı delta 18'de oksijen tüketiminin vahşi tip kontrollere kıyasla önemli ölçüde azaldığını göstermiştir. Bununla birlikte, fıçı delta 18 sineklerinin ortalama kütlesi, vahşi tip kontrollerinkinden daha düşüktü.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Using a Respiratory Chamber to Measure Metabolic Rate in Drosophila melanogaster

Measuring O2 Consumption in Drosophila melanogaster Using Coulometric Microrespirometry

Coulometric microrespirometry is a straightforward, inexpensive method for measuring the O2 consumption of small organisms while maintaining a stable ...