首先将 0.0005 克 NBT 溶解在 10 微升 DMSO 中。涡旋 15 分钟后,加入 90 微升含钙和镁的 Hank's 平衡盐溶液或 HBSS 以及 1 微升测试物质。再次,涡旋管最多两分钟。
为了进行NBT载玻片测试,轻轻地混合并转移两微升先前制备的活化多形核中性粒细胞到干净的载玻片上。将载玻片在 37 摄氏度的加湿室中孵育 20 分钟。接下来,在细胞上加入一微升NBT工作溶液。
再次孵育 20 分钟,避光。干燥载玻片后,通过在每个孔中滴一滴甲醇一分钟来固定它。用 0.03 番红将载玻片染色一分钟。
在每个孔中,计数 100 个随机细胞,区分有和没有甲臜沉积物的中性粒细胞。为了进行NBT分光光度法测定,轻轻地混合并转移90微升先前制备的活化多形核中性粒细胞到干净的微量离心管中。然后小心地加入 20 微升 6 毫摩尔 NBT 溶液,并将试管在黑暗中孵育 37 摄氏度 20 分钟。
孵育后,加入 100 微升 10%SDS 并涡旋。用吸头以 60% 振幅超声处理,增加五个周期,每个周期 15 秒,间隔 15 秒。以 12, 000g 离心 5 分钟。
将 60 微升上清液转移到透明的底部 96 孔板中,并测量上清液产物在 570 纳米处的吸光度。分光光度法测定的结果表明,与fMLP组和对照组相比,100纳摩尔PMA诱导ROS产生升高。NBT载玻片测试结果证实了分光光度法结果,显示与fMLP相比,PMA是最强烈的ROS产生诱导刺激。