Name: Nitrotetrazolium Blue Chloride (NBT) Assay for Evaluating ROS Production
Uploaded: 2024-02-09T12:40:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Nitrotetrazolium Blue Chloride NBT Assay for Evaluating ROS Production at JoVE.com

nitrotetrazolium blue chloride (nbt) assay for evaluating ros production

בדיקות פונקציונליות נויטרופילים לסינון מסלולי איתות שונים

Neutrophils are the most abundant innate immune cells in human blood and are known to play a major part in infection and inflammation, being the first responders to arrive at the site of tissue damage1. In recent years, there has been a growing recognition of the crucial role that neutrophils play in a variety of diseases and in supporting homeostasis2. Neutrophils not only have tightly regulated signaling themselves, but also participate in the regulation of other components of the immune system3,4,5. Therefore, investigating neutrophils and their many unusual cellular functions, such as chemotaxis, reverse migration6, phagocytosis7, respiratory burst8, and the release of neutrophil extracellular traps (NETs)7, is imperative in numerous research contexts where it is necessary to assess the potential neutrophil functional, morphological, or molecular changes triggered by specific conditions under analysis.
Freshly isolated neutrophils are terminally differentiated, short-lived, highly dynamic, and easily activated9. However, an efficient storage method that does not affect the neutrophil responses has not yet been achieved, making it challenging to perform multiple assays that must be uninterrupted. Furthermore, previously described functional analyses10,11, based on assays that require cytometry and/or fluorescent staining, may not be a viable choice when a broad and initial evaluation of the neutrophil is needed.
To address these issues, this protocol describes a set of tests that can be carried out following a single isolation process, including the evaluation of cell viability, reactive oxygen species (ROS) production, real-time migration, and phagocytosis of Saccharomyces cerevisiae, whose results can be used to reason in-depth follow-up studies. This procedure, named NeutroFun Screen, was designed to encompass the leading effector activities, except degranulation, and can be completed in an average time of 4 h, including 1 h of activation. Additionally, the remaining cells can be used for more detailed approaches like omics studies. The advantage of this method lies in its balance between speed, comprehensiveness, cost, and accuracy.
Furthermore, there is a way to easily observe a preliminary suggestion of NETs, without specific markers, but enough to indicate if further efforts in that direction would be worthwhile. The diversity of functions tested aims to combine common points among tests, reducing the analysis time and expenses. The main goal of this method is to provide a balanced, functional analysis regarding speed, comprehensiveness, cost, and accuracy that allows for an overview of the neutrophil&#39;s response, making it a useful initial step in investigating the effects of novel stimuli on normal density neutrophils.

מחבר זרקור: איזון מהירות, עלות ודיוק בהערכת פונקציות נויטרופילים עם פרוטוקול מסך NeutroFun 

סדרה של טכניקות סינון לסקירה מהירה של פונקציית נויטרופיל

The NeutroFun Screen Protocol provides a group of functional tests that use low-cost chemicals and can be performed in a single experiment from fresh neutrophils. This allows a preliminary evaluation of some major neutrophil functions to guide more laborious and expensive follow-up studies. Neutrophil research employs various modulation conditions.Such as cytokines, peptides, microbial products, and physical stimuli. Additionally, analyses flow cytometry, multiomics, microfluidic devices and immuno cytochemistry. The extensive brand of conditions and assays used in combination makes the workflow of neutrophil research long, laborious and expensive.Typically in these reduces, the number of conditions tested or the number of tests performed, the current state of the art methods require extensive configurables, many cells and lengthy preparation procedures. Our protocol NeutroFun Screen offers a quicker and more cost-effective approach to evaluate cell functionality compared to other methods. This is achieved by combining various analyses within the protocol, while maintaining accuracy and comprehensiveness in the results.Two researchers performed this workflow simultaneously for a quick overview of the neutrophil function. Researcher one isolates the PMNs, adjusts concentration and incubates the activation systems, whereas researcher two prepares materials for the subsequent cases. Then researcher one performs phagocytosis, and colorimetric NBT assays while researcher two conducts real-time migration and NBT slide tests.

Watch this Scientific Journal Video about Nitrotetrazolium Blue Chloride NBT Assay for Evaluating ROS Production at JoVE.com

Nitrotetrazolium Blue Chloride (NBT) Assay for Evaluating ROS Production  

Nitrotetrazolium Blue Chloride (NBT) Assay להערכת ייצור ROS

התחל על ידי המסת 0.0005 גרם של NBT ב 10 מיקרוליטר של DMSO. לאחר ערבול של 15 דקות, מוסיפים 90 מיקרוליטר של תמיסת מלח מאוזנת של האנק או HBSS עם סידן ומגנזיום ומיקרוליטר אחד של חומרי הבדיקה. שוב, מערבלים את הצינור עד שתי דקות.כדי לבצע את בדיקת השקופיות של NBT, ערבבו והעבירו בעדינות שני מיקרוליטרים של נויטרופילים פולימורפו-גרעיניים פעילים שהוכנו קודם לכן לשקופית זכוכית נקייה. לדגור על המגלשה בתא לח ב 37 מעלות צלזיוס במשך 20 דקות. לאחר מכן, הוסף מיקרוליטר אחד של תמיסת העבודה NBT מעל התאים.יש לדגור שוב במשך 20 דקות, תוך הגנה מפני אור. לאחר ייבוש המגלשה, תקן אותה על ידי מריחת טיפת מתנול בכל באר למשך דקה. מכתימים את המגלשה ב-0.03 ספרנין למשך דקה נוספת.בכל באר, לספור 100 תאים אקראיים, התמיינות נויטרופילים עם וללא משקעי פורמזן. כדי לבצע את בדיקת הספקטרופוטומטריה של NBT, ערבבו בעדינות והעבירו 90 מיקרוליטר של נויטרופילים פולימורפו-גרעיניים פעילים שהוכנו בעבר לצינור מיקרוצנטריפוגה נקי. לאחר מכן מוסיפים בזהירות 20 מיקרוליטר של תמיסת NBT שישה מילימולרית ודגרים על הצינור בחושך במשך 37 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות.לאחר הדגירה מוסיפים 100 מיקרוליטר של 10% SDS ווורטקס. Sonicate עם קצה סוניקט באמפליטודה של 60%, ומוסיף חמישה מחזורים של 15 שניות כל אחד ומרווחים של 15 שניות. צנטריפוגה ב 12, 000 גרם במשך חמש דקות.מעבירים 60 מיקרוליטר של סופרנאטנט לצלחת תחתונה שקופה בת 96 בארות ומודדים את ספיגת תוצר הסופרנאטנט ב-570 ננומטר. תוצאות הבדיקה הספקטרופוטומטרית הצביעו על כך ש-100 ננו-מולארי PMA גרם לייצור ROS מוגבר בהשוואה לקבוצות fMLP וקבוצת ביקורת. תוצאות בדיקת השקופיות של NBT אישרו את התוצאות הספקטרופוטומטריות, והראו PMA כגירוי האינטנסיבי ביותר לייצור ROS בהשוואה ל-fMLP.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Nitrotetrazolium Blue Chloride (NBT) Assay for Evaluating ROS Production

A Set of Screening Techniques for a Quick Overview of the Neutrophil Function

Neutrophils are known as one of the first lines of defense in the innate immune response and can perform many particular cellular functions, such as ...

Neutrophil Isolation and Activation

בידוד והפעלה של נויטרופילים

Neutrophil Phagocytosis Assay

בדיקת פגוציטוזה נויטרופילים

Real-Time Polymorphonuclear Neutrophils (PMN) Chemotaxis Assay

בדיקת כימוטקסיס פולימורפו-גרעינית בזמן אמת (PMN)

Neutrophil Extracellular Trap (NET) Suggestive Assay

מלכודת חוץ-תאית נויטרופילים (NET) בדיקה סוגסטיבית