0.0005 마이크로리터의 DMSO에 NBT 10g을 용해시키는 것으로 시작합니다. 15분 동안 소용돌이친 후 칼슘과 마그네슘이 함유된 Hank's Balanced Salt Solution 또는 HBSS 90마이크로리터와 테스트 물질 1마이크로리터를 추가합니다. 다시 말하지만, 최대 2분 동안 튜브를 소용돌이치게 합니다.
NBT 슬라이드 테스트를 수행하려면 이전에 준비한 활성화된 다형핵 호중구 2마이크로리터를 부드럽게 혼합하여 깨끗한 유리 슬라이드에 옮깁니다. 섭씨 37도의 가습 챔버에서 20분 동안 슬라이드를 배양합니다. 다음으로, 셀 위에 NBT 작업 용액 1마이크로리터를 추가합니다.
빛으로부터 보호하면서 20분 동안 다시 배양합니다. 슬라이드를 건조시킨 후 각 웰에 메탄올 한 방울을 1분 동안 도포하여 고정합니다. 슬라이드에 0.03 사프라닌을 추가로 1분 동안 묻힙니다.
각 웰에서 100개의 무작위 세포를 세어 포르마잔 침전물이 있는 호중구와 없는 호중구를 구별합니다. NBT 분광광도법 분석을 수행하려면 이전에 준비된 활성화된 다형핵 호중구 90마이크로리터를 부드럽게 혼합하여 깨끗한 미세원심분리기 튜브로 옮깁니다. 그런 다음 20 마이크로 리터의 6 밀리몰 NBT 용액을 조심스럽게 넣고 어두운 곳에서 섭씨 37도에서 20 분 동안 튜브를 배양합니다.
배양 후 100 마이크로 리터의 10 % SDS와 Vortex를 첨가하십시오. 60 % 진폭에서 팁 초음파 처리로 초음파 처리하여 각각 15 초와 15 초 간격의 5 사이클을 추가합니다. 12에 분리기, 5 분 동안 000g.
60마이크로리터의 상층액을 투명한 바닥 96웰 플레이트로 옮기고 570나노미터에서 상층액 생성물의 흡광도를 측정합니다. 분광광도계 분석 결과 100 나노몰 PMA가 fMLP 및 대조군에 비해 ROS 생산량 증가를 유도한 것으로 나타났습니다. NBT 슬라이드 테스트 결과는 분광광도계 결과를 확증하여 PMA가 fMLP에 비해 가장 강력한 ROS 생성 유도 자극임을 보여주었습니다.