ابدأ بتطبيع عينات البروتين المسيل للدموع البشري إلى 50 ميكروغرام من البروتين. ثم أضف 200 مليمول ديثيوثريتول ، أو DTT ، إلى تركيز نهائي قدره 20 مليمول DTT ، محتضن عند 95 درجة مئوية لمدة 10 دقائق. بعد تبريد محلول البروتين إلى درجة حرارة الغرفة ، أضف 400 ملليمولار يودواسيتاميد إلى تركيز نهائي قدره 40 مللي مولار ، ثم احتضانه في الظلام في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقائق.
بعد ذلك ، أضف 12٪ حمض الفوسفوريك المائي بنسبة واحد إلى 10 ، مما ينتج عنه تركيز نهائي 1.2٪. دوامة الخليط لفترة وجيزة لخلط الحل. أضف المخزن المؤقت لربط البروتين بنسبة واحد إلى ستة قبل الدوامة مرة أخرى.
قم بفك غطاء عمود الدوران الصغير الذي يحبس التعليق وقم بتجميع عمود الدوران على أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 2 ملليلتر لجمع التدفق. أضف ما يصل إلى 200 ميكرولتر من خليط تحلل البروتين المحمض في العمود. أجهزة الطرد المركزي العمود في 4000 G لمدة 20 ثانية.
بعد ذلك ، أضف 150 ميكرولترا من المخزن المؤقت لربط البروتين وأجهزة الطرد المركزي كما كان من قبل لغسل البروتين المعلق. قم بتجميع العمود الصغير لمحاصرة التعليق على أنبوب طرد مركزي دقيق جديد سعة 1.5 ملليلتر. أضف بعناية 20 ميكرولتر من محلول الهضم TEAB على الفلتر الموجود داخل عمود الدوران ، وتجنب الفقاعات والفجوات الهوائية.
قم بتغطية عمود الدوران الصغير الذي يحبس التعليق بإحكام لمنع التبخر. احتضان عند 47 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة في خلاط حراري دون رج. الببتيدات Elute مع 40 ميكرولتر من 50 مليمول TEAB.
ثم أجهزة الطرد المركزي في 4000 غرام لمدة 20 ثانية. أضف الآن 40 ميكرولترا من حمض الفورميك 0.2٪ وأجهزة الطرد المركزي كما كان من قبل. أخيرا ، أضف 35 ميكرولترا من 0.2٪ حمض الفورميك و 50٪ إلى الأسيتونيتريل قبل الطرد المركزي مرة أخرى.
اسحب المواد الثلاثة وجففها باستخدام جهاز طرد مركزي مفرغ. بمجرد التجفيف ، قم بتخزين العينات عند 80 درجة مئوية لتحليلها في المستقبل. أسفر بحث الاستحواذ المعتمد على البيانات عن إجمالي 1183 بروتينا زائدا أو ناقصا 118 في مجموعة محاصرة التعليق ، و 874 بروتينا زائد أو ناقص 70 عند 1٪ FDR في مجموعة المحلول.
كشف تحليل الأنطولوجيا الجينية عن بروتينات مماثلة لكلا النهجين مع الوظيفة الرئيسية مثل النشاط التحفيزي المرتبط وتنظيم الوظيفة الجزيئية.