Suspension-Trapping Sample Preparation of Human Tear Protein

首先将人泪液蛋白样品归一化为 50 微克蛋白质。然后加入 200 毫摩尔二硫苏糖醇或 DTT，至终浓度为 20 毫摩尔 DTT，在 95 摄氏度下孵育 10 分钟。将蛋白质溶液冷却至室温后，加入 400 毫摩尔碘乙酰胺至终浓度为 40 毫摩尔，然后在室温下避光孵育 10 分钟。

接下来，以 1 比 10 的比例加入 12% 磷酸水溶液，最终浓度为 1.2%。短暂涡旋混合物以混合溶液。在再次涡旋之前，以 1 比 6 的比例加入蛋白质结合缓冲液。

打开悬浮捕获微量离心柱的盖子，将离心柱组装到两毫升微量离心管上以收集流出物。向色谱柱中加入多达 200 微升酸化蛋白裂解物混合物。将色谱柱以4000G离心20秒。

接下来，加入 150 微升蛋白质结合缓冲液并像以前一样离心以洗涤悬浮蛋白质。将悬浮捕获微量柱组装到新的1.5毫升微量离心管上。小心地将 20 微升 TEAB 消解缓冲液添加到离心柱内的过滤器上，避免出现气泡和气隙。

盖上悬浮捕获微离心柱的盖子，以防止蒸发。在 47 摄氏度的热混合器中孵育一小时，不要摇晃。用 40 微升 50 毫摩尔 TEAB 洗脱肽。

然后以 4000 G 离心 20 秒。现在加入 40 微升 0.2% 甲酸并像以前一样离心。最后，加入 35 微升 0.2% 甲酸和 50% 乙腈中，然后再次离心。

拉出三种洗脱液并使用真空离心机干燥。干燥后，将样品储存在 80 摄氏度以备将来分析。数据依赖性采集搜索在悬浮捕获组中共产生 1183 个正负 118 个蛋白质，在溶液内组中产生 874 个正负 70 个蛋白质（1%FDR）。

基因本体分析揭示了两种方法相似的蛋白质组，主要功能是结合催化活性和分子功能调控。