Begynd med at normalisere de menneskelige tåreproteinprøver til 50 mikrogram protein. Derefter tilsættes 200 millimolær dithiothretol eller DTT til en endelig koncentration på 20 millimolær DTT, inkuberet ved 95 grader Celsius i 10 minutter. Efter afkøling af proteinopløsningen til stuetemperatur tilsættes 400 millimolært iodoacetamid til en endelig koncentration på 40 millimolære og inkuberes derefter i mørke ved stuetemperatur i 10 minutter.
Derefter tilsættes 12% vandig fosforsyre i forholdet en til 10, hvilket resulterer i en 1,2% endelig koncentration. Vortex blandingen kort for at blande opløsningen. Tilsæt proteinbindende buffer i et til seks forhold, før hvirvlen igen.
Fjern hætten på suspensionsfangende mikrospinsøjlen, og saml centrifugeringssøjlen på et to milliliter mikrocentrifugerør for at opsamle gennemstrømning. Tilsæt op til 200 mikroliter syrnet proteinlysatblanding i søjlen. Centrifuger kolonnen ved 4000 G i 20 sekunder.
Derefter tilsættes 150 mikroliter proteinbindende buffer og centrifugeres som før for at vaske det suspenderede protein. Saml suspensionsfangemikrosøjlen på et nyt 1,5 ml mikrocentrifugerør. Tilsæt forsigtigt 20 mikroliter TEAB fordøjelsesbuffer på filteret inde i centrifugeringssøjlen, undgå bobler og luftspalter.
Sæt låget på affjedringsfangemikrospinsøjlen sikkert for at forhindre fordampning. Inkuber ved 47 grader Celsius i en time i en termisk mixer uden at ryste. Eluere peptider med 40 mikroliter 50 millimolær TEAB.
Derefter centrifugeres det ved 4000 G i 20 sekunder. Tilsæt nu 40 mikroliter 0,2% myresyre og centrifuger som før. Til sidst tilsættes 35 mikroliter 0,2% myresyre og 50% til acetonitril, før der centrifugeres igen.
Træk de tre elueringsmidler og tør dem ved hjælp af en vakuumcentrifuge. Når prøverne er tørret, opbevares de ved 80 grader Celsius til fremtidig analyse. Den dataafhængige erhvervelsessøgning gav i alt 1183 plus eller minus 118 proteiner i suspensionsfangstgruppen og 874 plus eller minus 70 proteiner ved 1% FDR i gruppen i opløsningen.
Genontologianalyse afslørede lignende proteomer for begge tilgange med hovedfunktion som bindende katalytisk aktivitet og molekylær funktionsregulering.
