Begin met het normaliseren van de menselijke traaneiwitmonsters tot 50 microgram eiwit. Voeg vervolgens 200 millimolair dithiothreitol, of DTT, toe aan een eindconcentratie van 20 millimolair DTT, geïncubeerd bij 95 graden Celsius gedurende 10 minuten. Voeg na afkoeling van de eiwitoplossing tot kamertemperatuur 400 millimolair jodoacetamide toe tot een eindconcentratie van 40 millimolair en incubeer vervolgens gedurende 10 minuten in het donker bij kamertemperatuur.
Voeg vervolgens 12% waterig fosforzuur toe in een verhouding van één op 10, wat resulteert in een eindconcentratie van 1,2%. Draai het mengsel kort om de oplossing te mengen. Voeg eiwitbindende buffer toe in een verhouding van één tot zes voordat u opnieuw vortexeert.
Maak de dop van de microspinkolom voor het vangen van de suspensie los en monteer de spinkolom op een microcentrifugebuis van twee milliliter om de doorstroming op te vangen. Voeg maximaal 200 microliter aangezuurd eiwitlysaatmengsel toe aan de kolom. Centrifugeer de kolom gedurende 20 seconden bij 4000 G.
Voeg vervolgens 150 microliter eiwitbindingsbuffer toe en centrifugeer zoals voorheen om het gesuspendeerde eiwit te wassen. Monteer de microkolom voor het vangen van de suspensie op een nieuwe microcentrifugebuis van 1,5 milliliter. Voeg voorzichtig 20 microliter TEAB-digestiebuffer toe aan het filter in de centrifugekolom, vermijd luchtbellen en luchtspleten.
Sluit de microspinkolom van de ophanging stevig af om verdamping te voorkomen. Incubeer bij 47 graden Celsius gedurende een uur in een thermische mixer zonder te schudden. Elute peptiden met 40 microliter 50 millimolaire TEAB.
Centrifugeer het vervolgens gedurende 20 seconden op 4000 G. Voeg nu 40 microliter 0,2% mierenzuur toe en centrifugeer zoals voorheen. Voeg ten slotte 35 microliter 0,2% mierenzuur en 50% toe aan acetonitril voordat u opnieuw centrifugeert.
Trek de drie eluenten eruit en droog ze met een vacuümcentrifuge. Eenmaal gedroogd, bewaart u de monsters bij 80 graden Celsius voor toekomstige analyse. Het zoeken naar gegevensafhankelijke acquisitie leverde in totaal 1183 plus of min 118 eiwitten op in de suspensie-trapgroep en 874 plus of min 70 eiwitten bij 1%FDR in de groep in de oplossing.
Genontologie-analyse onthulde vergelijkbare proteomen voor beide benaderingen met als belangrijkste functie bindende katalytische activiteit en moleculaire functieregulatie.