Commencez par normaliser les échantillons de protéines lacrymales humaines à 50 microgrammes de protéines. Ajoutez ensuite 200 millimolaires de dithiothréitol, ou DTT, à une concentration finale de 20 millimolaires de DTT, incubée à 95 degrés Celsius pendant 10 minutes. Après avoir refroidi la solution protéique à température ambiante, ajoutez 400 millimolaires d’iodoacétamide à une concentration finale de 40 millimolaires, puis incubez dans l’obscurité à température ambiante pendant 10 minutes.
Ensuite, ajoutez 12 % d’acide phosphorique aqueux dans un rapport de un à 10, ce qui donne une concentration finale de 1,2 %. Faire tourner brièvement le mélange pour mélanger la solution. Ajouter le tampon de liaison aux protéines dans un rapport de un à six avant de tourbillonner à nouveau.
Décapsulez la colonne de micro-centrifugation de piégeage de la suspension et assemblez la colonne de centrifugation sur un tube de microcentrifugation de deux millilitres pour recueillir l’écoulement. Ajoutez jusqu’à 200 microlitres de mélange de lysat de protéines acidifiées dans la colonne. Centrifuger la colonne à 4000 G pendant 20 secondes.
Ensuite, ajoutez 150 microlitres de tampon de liaison aux protéines et centrifugez comme précédemment pour laver la protéine en suspension. Assemblez la micro-colonne de piégeage de la suspension sur un nouveau tube de microcentrifugation de 1,5 millilitre. Ajoutez délicatement 20 microlitres de tampon de digestion TEAB sur le filtre à l’intérieur de la colonne d’essorage, en évitant les bulles et les espaces d’air.
Bouchez solidement la colonne de micro-rotation qui emprisonne la suspension pour éviter l’évaporation. Incuber à 47 degrés Celsius pendant une heure dans un mélangeur thermique sans secouer. Peptides élués avec 40 microlitres de TEAB de 50 millimolaires.
Ensuite, centrifugez-le à 4000 G pendant 20 secondes. Ajoutez maintenant 40 microlitres d’acide formique à 0,2 % et centrifugez comme précédemment. Enfin, ajoutez 35 microlitres d’acide formique à 0,2 % et 50 % à l’acétonitrile avant de centrifuger à nouveau.
Tirez les trois éluants et séchez-les à l’aide d’une centrifugeuse sous vide. Une fois séchés, conservez les échantillons à 80 degrés Celsius pour une analyse future. La recherche d’acquisition dépendante des données a donné un total de 1183 protéines plus ou moins 118 dans le groupe piégeant en suspension, et 874 plus ou moins 70 protéines à 1% FDR dans le groupe en solution.
L’analyse de l’ontologie des gènes a révélé des protéomes similaires pour les deux approches, la fonction principale étant l’activité catalytique de liaison et la régulation de la fonction moléculaire.