मानव आंसू प्रोटीन के नमूनों को 50 माइक्रोग्राम प्रोटीन में सामान्य करके शुरू करें। फिर 20 मिलीमोलर डिथियोथ्रेइटोल, या डीटीटी को 20 मिलीमोलर डीटीटी की अंतिम एकाग्रता में जोड़ें, जिसे 10 मिनट के लिए 95 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट किया जाता है। कमरे के तापमान पर प्रोटीन समाधान को ठंडा करने के बाद, 40 मिलीमोलर आयोडोसिटामाइड को 40 मिलीमोलर की अंतिम एकाग्रता में जोड़ें, फिर 10 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर अंधेरे में इनक्यूबेट करें।
इसके बाद, एक से 10 अनुपात में 12% जलीय फॉस्फोरिक एसिड जोड़ें, जिसके परिणामस्वरूप 1.2% अंतिम एकाग्रता होती है। घोल को मिलाने के लिए मिश्रण को संक्षेप में भंवर करें। फिर से भंवर से पहले एक से छह अनुपात में प्रोटीन बाइंडिंग बफर जोड़ें।
सस्पेंशन ट्रैपिंग माइक्रो स्पिन कॉलम को अनकैप करें और प्रवाह एकत्र करने के लिए स्पिन कॉलम को दो मिलीलीटर माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब पर इकट्ठा करें। कॉलम में 200 माइक्रोलीटर तक अम्लीय प्रोटीन लाइसेट मिश्रण जोड़ें। 20 सेकंड के लिए 4000 जी पर कॉलम को सेंट्रीफ्यूज करें।
इसके बाद, निलंबित प्रोटीन को धोने के लिए पहले की तरह 150 माइक्रोलीटर प्रोटीन बाइंडिंग बफर और सेंट्रीफ्यूज जोड़ें। एक नए 1.5 मिलीलीटर माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब पर सस्पेंशन ट्रैपिंग माइक्रो कॉलम को इकट्ठा करें। बुलबुले और हवा के अंतराल से बचने के लिए, स्पिन कॉलम के अंदर फिल्टर पर 20 माइक्रोलीटर टीईएबी पाचन बफर को ध्यान से जोड़ें।
वाष्पीकरण को रोकने के लिए सस्पेंशन ट्रैपिंग माइक्रो स्पिन कॉलम को सुरक्षित रूप से कैप करें। बिना हिलाए थर्मल मिक्सर में एक घंटे के लिए 47 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें। 50 मिलीमोलर टीईएबी के 40 माइक्रोलीटर के साथ इल्यूट पेप्टाइड्स।
फिर इसे 20 सेकंड के लिए 4000 जी पर सेंट्रीफ्यूज करें। अब पहले की तरह 0.2% फॉर्मिक एसिड और सेंट्रीफ्यूज के 40 माइक्रोलीटर जोड़ें। अंत में, फिर से सेंट्रीफ्यूजिंग से पहले 0.2% फॉर्मिक एसिड के 35 माइक्रोलीटर और एसिटोनिट्राइल में 50% जोड़ें।
तीन एलुएंट्स खींचें और उन्हें वैक्यूम सेंट्रीफ्यूज का उपयोग करके सुखाएं। एक बार सूखने के बाद, भविष्य के विश्लेषण के लिए नमूने को 80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें। डेटा निर्भर अधिग्रहण खोज में सस्पेंशन ट्रैपिंग समूह में कुल 1183 प्लस या माइनस 118 प्रोटीन और इन-सॉल्यूशन समूह में 1% एफडीआर पर 874 प्लस या माइनस 70 प्रोटीन मिले।
जीन ऑन्कोलॉजी विश्लेषण ने बाध्यकारी उत्प्रेरक गतिविधि और आणविक कार्य विनियमन के रूप में मुख्य कार्य के साथ दोनों दृष्टिकोणों के लिए समान प्रोटिओम का खुलासा किया।