Suspension-Trapping Sample Preparation of Human Tear Protein

먼저 인간의 눈물 단백질 샘플을 50마이크로그램의 단백질로 정규화합니다. 그런 다음 200밀리몰 디티오트레이톨(DTT)을 최종 농도 20밀리몰 DTT에 넣고 섭씨 95도에서 10분 동안 배양합니다. 단백질 용액을 실온으로 냉각시킨 후 400밀리몰의 요오드아세트아미드를 최종 농도 40밀리몰에 첨가한 다음 실온에서 10분 동안 어두운 곳에서 배양합니다.

다음으로 12% 수성 인산을 1:10의 비율로 첨가하여 1.2%의 최종 농도를 만듭니다. 혼합물을 잠시 소용돌이쳐 용액을 혼합합니다. 다시 소용돌이치기 전에 단백질 결합 완충액을 1:6 비율로 추가합니다.

서스펜션 트래핑 마이크로 스핀 컬럼의 캡을 풀고 스핀 컬럼을 2밀리리터 마이크로 원심분리기 튜브에 조립하여 플로우스루를 수집합니다. 최대 200마이크로리터의 산성화된 단백질 용해물 혼합물을 컬럼에 추가합니다. 컬럼을 4000G에서 20초 동안 원심분리합니다.

다음으로, 150 마이크로리터의 단백질 결합 완충액을 첨가하고 이전과 같이 원심분리기를 하여 부유 단백질을 세척합니다. 서스펜션 트래핑 마이크로 컬럼을 새로운 1.5mL 마이크로 원심분리기 튜브에 조립합니다. 20 마이크로리터의 TEAB 분해 완충액을 스핀 컬럼 내부의 필터에 조심스럽게 추가하여 기포와 에어 갭을 방지합니다.

증발을 방지하기 위해 서스펜션 트래핑 마이크로 스핀 컬럼을 단단히 캡하십시오. 섭씨 47도에서 흔들지 않고 열 믹서에서 1시간 동안 배양합니다. 40 마이크로 리터의 50 밀리몰 TEAB로 펩타이드를 용리합니다.

그런 다음 4000G에서 20초 동안 원심분리합니다. 이제 이전과 같이 40 마이크로 리터의 0.2 % 포름산과 원심 분리기를 추가합니다. 마지막으로 다시 원심분리하기 전에 35마이크로리터의 0.2% 포름산과 50%를 아세토니트릴에 첨가합니다.

세 가지 용리액을 당겨 진공 원심분리기를 사용하여 건조시킵니다. 건조되면 향후 분석을 위해 샘플을 섭씨 80도에서 보관합니다. 데이터 의존적 획득 검색은 현탁액 포획 그룹에서 총 1183개의 플러스 또는 마이너스 118개의 단백질을 산출했고, 용액 내 그룹에서 1% FDR에서 874개의 플러스 또는 마이너스 70개의 단백질을 산출했습니다.

유전자 온톨로지 분석은 결합 촉매 활성 및 분자 기능 조절과 같은 주요 기능을 가진 두 접근 방식 모두에서 유사한 단백질체를 보여주었습니다.