Begynn med å normalisere de humane tåreproteinprøvene til 50 mikrogram protein. Deretter tilsettes 200 millimolar dithiothreitol, eller DTT, til en endelig konsentrasjon på 20 millimolar DTT, inkubert ved 95 grader Celsius i 10 minutter. Etter avkjøling av proteinoppløsningen til romtemperatur, tilsett 400 millimolar iodoacetamid til en endelig konsentrasjon på 40 millimolar, og inkuber deretter i mørket ved romtemperatur i 10 minutter.
Deretter tilsettes 12% vandig fosforsyre i forholdet ett til 10, noe som resulterer i en 1,2% endelig konsentrasjon. Vortex blandingen kort for å blande løsningen. Tilsett proteinbindingsbuffer i forholdet én til seks før du virvler igjen.
Fjern hetten på mikrospinnkolonnen for opphengsfangst og monter spinnkolonnen på et to milliliters mikrosentrifugerør for å samle gjennomstrømning. Tilsett opptil 200 mikroliter surgjort proteinlysatblanding i kolonnen. Sentrifuger kolonnen ved 4000 G i 20 sekunder.
Deretter tilsettes 150 mikroliter proteinbindingsbuffer og sentrifuge som før for å vaske det suspenderte proteinet. Monter mikrokolonnen for opphengsfangst på et nytt mikrosentrifugerør på 1,5 milliliter. Tilsett forsiktig 20 mikroliter TEAB fordøyelsesbuffer på filteret inne i sentrifugeringskolonnen, unngå bobler og luftspalter.
Sett et sikkert lokk på opphenget som fanger mikrospinnkolonnen for å forhindre fordampning. Inkuber ved 47 grader Celsius i en time i en termisk mikser uten å riste. Elute peptider med 40 mikroliter 50 millimolar TEAB.
Deretter sentrifugerer den ved 4000 G i 20 sekunder. Nå tilsett 40 mikroliter 0,2% maursyre og sentrifuge som før. Til slutt, tilsett 35 mikroliter 0,2% maursyre og 50% acetonitril før sentrifugering igjen.
Trekk de tre eluentene og tørk dem med en vakuumsentrifuge. Når de er tørket, oppbevar prøvene ved 80 grader Celsius for fremtidig analyse. Det dataavhengige innsamlingssøket ga totalt 1183 pluss eller minus 118 proteiner i suspensjonsfangstgruppen, og 874 pluss eller minus 70 proteiner ved 1%FDR i løsningsgruppen.
Genontologisk analyse viste lignende proteomer for begge tilnærminger med hovedfunksjon som bindende katalytisk aktivitet og molekylær funksjonsregulering.