Comece normalizando as amostras de proteína lacrimal humana para 50 microgramas de proteína. Em seguida, adicione 200 ditiotreitol milimolar, ou TDT, a uma concentração final de 20 milimolares de TDT, incubada a 95 graus Celsius por 10 minutos. Depois de arrefecer a solução proteica à temperatura ambiente, adicionar iodoacetamida de 400 milimolares a uma concentração final de 40 milimolares e, em seguida, incubar no escuro à temperatura ambiente durante 10 minutos.
Em seguida, adicione 12% de ácido fosfórico aquoso em uma proporção de um para 10, resultando em uma concentração final de 1,2%. Vórtice a mistura brevemente para misturar a solução. Adicione o tampão de ligação às proteínas numa proporção de um para seis antes de voltar a agitar-se.
Desencape a coluna de micro spin de aprisionamento da suspensão e monte a coluna de spin em um tubo de microcentrífuga de dois mililitros para coletar o fluxo. Adicione até 200 microlitros de mistura de lisado proteico acidificado na coluna. Centrifugar a coluna a 4000 G durante 20 segundos.
Em seguida, adicione 150 microlitros de tampão de ligação à proteína e centrífuga como antes para lavar a proteína em suspensão. Monte a microcoluna de aprisionamento da suspensão em um novo tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitro. Adicione cuidadosamente 20 microlitros de tampão de digestão TEAB no filtro dentro da coluna de rotação, evitando bolhas e lacunas de ar.
Tampar com segurança a coluna de micro spin de aprisionamento da suspensão para evitar a evaporação. Incubar a 47 graus Celsius por uma hora em uma batedeira térmica sem agitar. Peptídeos eluídos com 40 microlitros de TEAB 50 milimolares.
Em seguida, centrifugar a 4000 G por 20 segundos. Agora adicione 40 microlitros de ácido fórmico a 0,2% e centrífuga como antes. Por último, adicione 35 microlitros de ácido fórmico a 0,2% e 50% à acetonitrila antes de centrifugar novamente.
Puxe os três eluentes e seque-os usando uma centrífuga a vácuo. Depois de secas, armazene as amostras a 80 graus Celsius para análises futuras. A busca de aquisição dependente de dados produziu um total de 1183 mais ou menos 118 proteínas no grupo de aprisionamento de suspensão, e 874 mais ou menos 70 proteínas a 1% FDR no grupo em solução.
A análise da ontologia gênica revelou proteomas semelhantes para ambas as abordagens, com função principal como atividade catalítica de ligação e regulação da função molecular.