Börja med att normalisera de mänskliga tårproteinproverna till 50 mikrogram protein. Tillsätt sedan 200 millimolar ditiotreitol, eller DTT, till en slutlig koncentration av 20 millimolar DTT, inkuberad vid 95 grader Celsius i 10 minuter. Efter att ha kylt proteinlösningen till rumstemperatur, tillsätt 400 millimolar jodacetamid till en slutlig koncentration av 40 millimolar, inkubera sedan i mörker vid rumstemperatur i 10 minuter.
Tillsätt sedan 12 % vattenhaltig fosforsyra i förhållandet ett till 10, vilket resulterar i en slutlig koncentration på 1,2 %. Blanda blandningen en kort stund för att blanda lösningen. Tillsätt proteinbindningsbuffert i förhållandet ett till sex innan du virvlar igen.
Lossa locket på den upphängda mikrospinnkolonnen och montera spinnkolonnen på ett två milliliters mikrocentrifugrör för att samla upp genomströmningen. Tillsätt upp till 200 mikroliter surgjord proteinlysatblandning i kolonnen. Centrifugera kolonnen vid 4000 G i 20 sekunder.
Tillsätt sedan 150 mikroliter proteinbindande buffert och centrifugera som tidigare för att tvätta det suspenderade proteinet. Montera den upphängda mikrokolonnen på ett nytt 1.5 ml mikrocentrifugrör. Tillsätt försiktigt 20 mikroliter TEAB-rötningsbuffert på filtret inuti centrifugeringskolonnen, undvik bubblor och luftspalter.
Täck över den upphängda mikrospinnkolonnen för att förhindra avdunstning. Inkubera vid 47 grader Celsius i en timme i en termisk mixer utan att skaka. Eluera peptider med 40 mikroliter 50 millimolar TEAB.
Centrifugera den sedan vid 4000 G i 20 sekunder. Tillsätt nu 40 mikroliter 0,2% myrsyra och centrifugera som tidigare. Tillsätt slutligen 35 mikroliter 0,2 % myrsyra och 50 % till acetonitril innan du centrifugerar igen.
Dra ut de tre eluenterna och torka dem med en vakuumcentrifug. När proverna har torkat, förvara dem vid 80 grader Celsius för framtida analys. Den databeroende insamlingssökningen gav totalt 1183 plus eller minus 118 proteiner i suspensionsfångstgruppen och 874 plus eller minus 70 proteiner vid 1 % FDR i lösningsgruppen.
Analys av genontologi avslöjade liknande proteom för båda metoderna med huvudfunktion som bindande katalytisk aktivitet och molekylär funktionsreglering.
