İnsan gözyaşı protein örneklerini 50 mikrogram proteine normalleştirerek başlayın. Daha sonra, 10 dakika boyunca 95 santigrat derecede inkübe edilmiş 20 milimolar DTT'nin nihai konsantrasyonuna 200 milimolar ditiotreitol veya DTT ekleyin. Protein çözeltisini oda sıcaklığına soğuttuktan sonra, 40 milimolar nihai konsantrasyona 400 milimolar iyodoasetamid ekleyin, ardından karanlıkta oda sıcaklığında 10 dakika inkübe edin.
Daha sonra, bire 10 oranında %12 sulu fosforik asit ekleyin ve %1.2'lik bir nihai konsantrasyon elde edin. Çözeltiyi karıştırmak için karışımı kısaca vorteksleyin. Tekrar girdap yapmadan önce bir ila altı oranında protein bağlayıcı tampon ekleyin.
Süspansiyon tutucu mikro döndürme kolonunun kapağını açın ve akışı toplamak için döndürme kolonunu iki mililitrelik bir mikrosantrifüj tüpüne monte edin. Kolona 200 mikrolitreye kadar asitlendirilmiş protein lizat karışımı ekleyin. Kolonu 4000 G'de 20 saniye santrifüjleyin.
Daha sonra, 150 mikrolitre protein bağlayıcı tampon ekleyin ve askıda proteini yıkamak için daha önce olduğu gibi santrifüjleyin. Süspansiyon tutucu mikro kolonunu yeni bir 1.5 mililitrelik mikrosantrifüj tüpüne monte edin. Kabarcıklardan ve hava boşluklarından kaçınarak sıkma kolonunun içindeki filtreye dikkatlice 20 mikrolitre TEAB sindirim tamponu ekleyin.
Buharlaşmayı önlemek için süspansiyon tutucu mikro döndürme kolonunu güvenli bir şekilde kapatın. 47 santigrat derecede bir saat boyunca bir termal karıştırıcıda çalkalamadan inkübe edin. 40 mikrolitre 50 milimolar TEAB içeren elute peptitleri.
Daha sonra 4000 G'de 20 saniye santrifüjleyin. Şimdi 40 mikrolitre% 0.2 formik asit ekleyin ve daha önce olduğu gibi santrifüjleyin. Son olarak, tekrar santrifüjlemeden önce 35 mikrolitre %0.2 formik asit ve asetonitril'e %50 ekleyin.
Üç eluenti çekin ve bir vakum santrifüjü kullanarak kurutun. Kuruduktan sonra, gelecekteki analizler için numuneleri 80 santigrat derecede saklayın. Veriye bağlı edinim araştırması, süspansiyon yakalama grubunda toplam 1183 artı veya eksi 118 protein ve çözelti içi grupta %1 FDR'de 874 artı veya eksi 70 protein verdi.
Gen ontolojisi analizi, ana işlevi bağlayıcı katalitik aktivite ve moleküler fonksiyon regülasyonu olan her iki yaklaşım için de benzer proteomlar ortaya koymuştur.