Commencez par extraire lâADN gĂ©nomique des feuilles de bambou de type sauvage et infectĂ©es par Agrobacterium. Amplifier lâADN gĂ©nomique contenant le site cible des gĂšnes cibles Ă partir de feuilles de bambou de type sauvage et infectĂ©es par Agrobacterium en utilisant les conditions de PCR suivantes. AprĂšs la PCR, effectuez la digestion de lâenzyme endonuclĂ©ase en prĂ©parant un mĂ©lange rĂ©actionnel contenant un microlitre dâage-1, un microgramme de produits PCR et un tampon 10X de cinq microlitres.
Ensuite, ajoutez de lâeau jusquâĂ un volume final de 50 microlitres. Incubez le mĂ©lange de digestion Ă 37 degrĂ©s Celsius pendant une heure. Ă lâaide de lâĂ©lectrophorĂšse sur gel, analysez la proportion de fragments dâADN digĂ©rĂ©s.
Comparez les fragments digĂ©rĂ©s des Ă©chantillons de type sauvage et dâĂ©chantillons infectĂ©s par Agrobacterium pour Ă©valuer lâefficacitĂ© de lâĂ©dition de gĂšnes. Exposez les plants de bambou Ă des conditions dâintensitĂ© lumineuse Ă©levĂ©e pour augmenter la quantitĂ© de lumiĂšre absorbĂ©e et lâactivation du systĂšme de photoprotection des feuilles. Ensuite, allumez le fluorimĂštre IMAGING-PAM et rĂ©glez lâintensitĂ© de la lumiĂšre actinique pour mesurer la fluorescence chlorophyllienne in vivo du photosystĂšme II des feuilles de bambou.
La couleur rouge de la voie bĂȘta produite par le gĂšne RUBY indique une expression gĂ©nique rĂ©ussie mĂ©diĂ©e par Agrobacterium dans les feuilles de bambou. Sur les quatre souches dâAgrobacterium, la souche GV3101 a causĂ© lâaccumulation la plus importante de voies bĂȘta dans les feuilles de bambou infectĂ©es. AprĂšs lâinfection par les constructions CRISPR-Cas9 et les traitements Ă haute luminositĂ©, certaines zones du limbe des feuilles ont montrĂ© des valeurs dâextinction non photochimiques plus faibles.
De plus, la digestion enzymatique et lâanalyse de sĂ©quençage ont confirmĂ© la mutation rĂ©ussie du gĂšne PeVDE dans les rĂ©gions Ă©ditĂ©es. Les rĂ©sultats du sĂ©quençage de Sanger du fragment PeVDE aprĂšs Ă©dition par sgRNA1 et sgRNA2 ont montrĂ© la dĂ©lĂ©tion dâun long fragment dans le gĂšne PeVDE. AprĂšs 30 jours dâinfection par Agrobacterium, les zones foliaires transfectĂ©es avec les ARNsg pour PeVDE et PeCCR5 prĂ©sentaient des valeurs dâextinction non photochimiques plus faibles.