للبدء ، في اليوم صفر ، وسط تمايز خال من المصل قبل التسخين أو وسط SFD يحتوي على مزيج 1 سيتوكين إلى 37 درجة مئوية. ثم ، تحت غطاء زراعة الأنسجة المعقمة ، أضف الوسط المكمل بالسيتوكين Mix 1 إلى كل بئر من صفيحة طاردة الخلايا المكونة من ستة آبار. لتحضير الخلايا ، قم باستنشاق وسط المزرعة من صفيحة من ستة آبار تحتوي على خلايا جذعية متعددة القدرات يسببها الإنسان أو خلايا IPS بشرية.
اغسلها باستخدام DPBS متبوعا باستنشاق DPBS. ثم أضف كاشف التفكك إلى الخلايا واحتضانها في درجة حرارة الغرفة لمدة دقيقة. بعد استنشاق كاشف التفكك هذا ، احتضان الخلايا لمدة ثلاث دقائق أخرى في درجة حرارة الغرفة.
ثم اضغط على اللوحة التي تحتوي على الخلايا 10 مرات على كل جانب لفصل مجموعات الخلايا. أضف ملليلتر واحد من وسط SFD المكمل بالسيتوكين المسخن مسبقا إلى الخلايا لكل بئر. باستخدام ماصة المراعي ، انقل مجموعات الخلايا من كل بئر إلى بئر واحد من لوحة طارد الخلايا التي تحتوي على الوسط مع السيتوكين Mix 1.
بعد إدخال اللوحة في الحاضنة ، حركها ذهابا وإيابا ، وكذلك جنبا إلى جنب ، لتفريق المحتوى بالتساوي واحتضانه لتشكيل الأجسام الجنينية ، أو EB. في اليوم التالي ، قم بتدوير لوحة طارد الخلايا التي تحتوي على EBs لجمعها في وسط الآبار. باستخدام ماصة باستور ، انقل تعليق EB من الآبار إلى أنبوب طرد مركزي سعة 15 ملليلتر.
انتظر من خمس إلى 10 دقائق حتى تستقر EBs في قاع الأنبوب. في هذه الأثناء ، اغسل ألواح طارد الخلايا بالماء المعقم أو DPBS لإزالة الخلايا المفردة أو الحطام. أضف ملليلتر من وسط SFD المكمل بالسيتوكين Mix 1 إلى كل بئر من اللوحة.
الآن ، قم بشفط المادة الطافية برفق من أنبوب الطرد المركزي دون إزاحة EBs. إعادة تعليق EBs في الحجم المحسوب لوسط SFD الذي يحتوي على مزيج 1 سيتوكين. أضف ملليلترا واحدا من معلق EB إلى كل بئر من لوحة طارد الخلايا المغسولة التي تحتوي بالفعل على ملليلتر من الوسط.
احتضان اللوحة بعد تشتيت EBs عن طريق تحريك اللوحة برفق كما ذكرنا من قبل. بعد جمع EBs في وسط الآبار ، أضف chiron على جانب كل بئر ، وتجنب الاتصال المباشر بالخلايا ، واحتضان الآبار كما هو موضح سابقا. في اليومين الثالث والسادس من التمايز، اجمع EBs وقم بإجراء تغييرات الوسائط كما هو موضح سابقا لليوم الأول.
استخدم وسط SFD المكمل بمزيج 3 سيتوكينات في اليوم الثالث واستخدم وسط SFD المكمل بمزيج 4 سيتوكينات في اليوم السادس. بعد جمع وتسوية EBs من لوحة طارد الخلية في أنبوب طرد مركزي سعة 15 ملليلتر ، كما هو موضح سابقا ، قم بشفط المادة الطافية ، ثم أضف ملليلتر واحد من كاشف تفكك الخلايا لكل بئر من EB تم جمعها في الأنبوب لإعادة تعليق EBs. بعد ذلك ، انقل ملليلتر واحد من تعليق EB هذا إلى كل بئر من لوحة طارد الخلايا المغسولة بالماء.
بعد احتضان اللوحة لمدة 10 دقائق في الحاضنة ، استخدم ماصة P1000 لفصل EBs في كل بئر عن طريق سحب الإصبع برفق لأعلى ولأسفل أكثر من 10 مرات. ثم أضف خمسة ملليلتر من المخزن المؤقت للغسيل لكل بئر من EBs المنفصلة. اجمع الخلايا في أنبوب طرد مركزي سعة 50 ملليلتر عن طريق تمريرها عبر مصفاة 40 ميكرون.
بعد عد الخلايا في التعليق المصفى ، قم بتدوير الخلايا لأسفل لمدة 10 دقائق عند 300 جرام. أعد تعليق الخلايا في 300 ميكرولتر من المخزن المؤقت للغسيل عن طريق سحب الإصبع برفق عدة مرات ، مما يضمن عدم وجود كتل. تابع عزل الخلايا الإيجابية CD34 باستخدام مجموعة ميكروبيدات CD34 وفقا لتعليمات الشركة المصنعة.
أظهرت EBs ذات النوعية الجيدة حافة محددة بحلول اليوم الثاني من التمايز وبدت واضحة ومشرقة عند ملاحظتها تحت المجهر. يشير وجود مناطق مظلمة إلى موت الخلايا داخل EBs. بعد معالجة chiron بتركيزات متفاوتة في اليوم الثاني ، كشف تحديد عدد الخلايا الإيجابية CD34 في اليوم الثامن من التمايز عن استجابة خط الخلية للعلاج.
أظهر قياس التدفق الخلوي أن التخصيب الإيجابي CD34 باستخدام الخرزات المغناطيسية يوفر حوالي 85٪ من الخلايا الإيجابية CD34.