首先，在第 0 天，将含有 Mix 1 细胞因子的无血清分化培养基或 SFD 培养基预热至 37 摄氏度。然后，在无菌组织培养罩下，将 Mix 1 补充细胞因子的培养基添加到细胞驱避剂六孔板的每个孔中。为了制备细胞，从含有人诱导的多能干细胞或人IPS细胞的六孔板中吸出培养基。
用 DPBS 清洗它们，然后吸出 DPBS。然后，将解离试剂添加到细胞中并在室温下孵育一分钟。吸出该解离试剂后，在室温下再孵育细胞三分钟。
然后，在每侧敲击含有细胞的板 10 次以分离细胞簇。每孔向细胞中加入 1 毫升预热的 Mix 1 补充细胞因子的 SFD 培养基。使用牧场移液管，将细胞簇从每个孔转移到含有含有混合1细胞因子的培养基的细胞驱避板的一个孔中。
将板引入培养箱后，来回移动以及左右移动，以均匀分散内容物并将其孵育以形成胚状体或EB。第二天，旋转含有EB的细胞驱虫板，将它们收集到孔的中心。使用巴斯德移液管，将EB悬浮液从孔转移到15毫升离心管中。
等待 5 到 10 分钟，让 EB 沉淀在管底部。同时，用无菌水或DPBS清洗细胞驱虫板，以去除单个细胞或碎片。向板的每个孔中加入 2 毫升 Mix 1 补充细胞因子的 SFD 培养基。
现在，轻轻地从离心管中吸出上清液，不要使EB移位。将EB重悬于含有Mix 1细胞因子的SFD培养基的计算体积中。将一毫升EB悬浮液加入已经含有两毫升培养基的洗涤细胞驱虫板的每个孔中。
如前所述，通过轻轻移动板来分散 EB 后孵育板。将EB收集在孔的中心后，在每个孔的侧面加入凯龙，避免与细胞直接接触，如前所述孵育孔。在分化的第三天和第六天，收集EB并按照前面的第一天进行培养基更换。
在第三天使用补充有 Mix 3 细胞因子的 SFD 培养基，在第 6 天使用补充有 Mix 4 细胞因子的 SFD 培养基。如前所述，将EB从细胞驱避板收集并沉淀到15毫升离心管中后，吸出上清液，然后在管中收集的每孔EB中加入1毫升细胞解离试剂以重悬EB。接下来，将一毫升该EB悬浮液转移到用水洗涤的细胞驱避板的每个孔中。
在培养箱中孵育板 10 分钟后，使用 P1000 移液器轻轻上下移液不超过 10 次，使每个孔中的 EB 解离。然后，在解离的 EB 的每孔中加入 5 毫升洗涤缓冲液。通过将细胞通过40微米过滤器，将细胞收集到50毫升离心管中。
在过滤悬浮液中计数细胞后，以 300g 将细胞旋转 10 分钟。轻轻移液几次，将细胞重悬于300微升洗涤缓冲液中，确保不存在结块。按照制造商的说明，使用 CD34 微珠试剂盒继续分离 CD34 阳性细胞。
在分化的第二天，质量良好的EB显示出明确的边缘，并且在显微镜下观察时显得清晰明亮。较暗区域的存在表明 EB 内的细胞死亡。在第二天用不同浓度的凯龙星处理后，在分化第八天量化CD34阳性细胞的数量，揭示了细胞系对治疗的反应。
流式细胞术显示，使用磁珠富集CD34阳性细胞可提供约85%的CD34阳性细胞。
