Til at begynde med, på dag nul, forvarmet serumfrit differentieringsmedium eller SFD-medium indeholdende Bland 1 cytokin til 37 grader Celsius. Derefter tilsættes Mix 1 cytokin-suppleret medium under en steril vævskulturhætte til hver brønd i en celleafvisende seks-brøndplade. For at forberede cellerne aspireres kulturmediet fra en plade med seks brønde, der indeholder menneskeskabte pluripotente STAMCELLER eller humane IPS-celler.
Vask dem med DPBS efterfulgt af aspirering af DPBS. Derefter tilsættes dissociationsreagenset til cellerne og inkuberes dem ved stuetemperatur i et minut. Efter aspirering af dette dissociationsreagens inkuberes cellerne i yderligere tre minutter ved stuetemperatur.
Tryk derefter på pladen, der indeholder cellerne, 10 gange på hver side for at løsne celleklyngerne. Tilsæt en milliliter forvarmet Mix 1 cytokinsuppleret SFD-medium til cellerne pr. Brønd. Ved hjælp af en græspipette overføres celleklyngerne fra hver brønd til en brønd i den celleafvisende plade, der indeholder mediet med Mix 1 cytokin.
Efter introduktion af pladen i inkubatoren skal du flytte den frem og tilbage såvel som side til side for at sprede indholdet jævnt og inkubere det til embryoide kroppe eller EB-dannelse. Den næste dag hvirvles celleafvisende plade, der indeholder EB'erne, for at samle dem i midten af brøndene. Brug en pasteurpipette til at overføre EB-suspensionen fra brøndene til et 15 ml centrifugerør.
Vent fem til 10 minutter på, at EB'erne sætter sig i bunden af røret. I mellemtiden vaskes de celleafvisende plader med sterilt vand eller DPBS for at fjerne enkeltceller eller snavs. Tilsæt to milliliter Mix 1 cytokin-suppleret SFD-medium til hver brønd på pladen.
Sug nu forsigtigt supernatanten ud af centrifugeglasset uden at løsne EB'erne. EB'erne resuspenderes i det beregnede volumen SFD-medium indeholdende Mix 1-cytokin. Tilsæt en milliliter EB-suspension til hvert hul i den vaskede celleafvisende plade, der allerede indeholder to ml medium.
Inkuber pladen efter spredning af EB'erne ved forsigtigt at bevæge pladen som nævnt før. Efter at have samlet EB'erne i midten af brøndene, tilsættes chiron på siden af hver brønd, undgå direkte kontakt med cellerne, Inkuber brøndene som tidligere demonstreret. På dag tre og seks af differentiering skal du indsamle EB'erne og udføre medieændringer som tidligere demonstreret for dag ét.
Brug SFD-medium suppleret med Mix 3-cytokiner på dag tre og brug SFD-medium suppleret med Mix 4-cytokiner på dag seks. Efter opsamling og bundfældning af EB'erne fra celleafvisende plade i et 15 ml centrifugeglas, som tidligere påvist, aspireres supernatanten, hvorefter der tilsættes en milliliter celledissociationsreagens pr. hul EB opsamlet i røret for at resuspendere EB'erne. Overfør derefter en milliliter af denne EB-suspension til hver brønd i den celleafvisende plade, der vaskes med vand.
Efter inkubation af pladen i 10 minutter i inkubatoren anvendes en P1000-pipette til at adskille EB'erne i hver brønd ved forsigtigt at pipettere op og ned højst 10 gange. Derefter tilsættes fem ml vaskebuffer pr. Hul dissocierede EB'er. Saml cellerne i et 50 ml centrifugerør ved at føre dem gennem en 40 mikron sil.
Efter at have talt cellerne i den filtrerede suspension, drej cellerne ned i 10 minutter ved 300 g. Resuspender cellerne i 300 mikroliter vaskebuffer ved forsigtigt pipettering et par gange, og sørg for, at der ikke er klumper til stede. Fortsæt med at isolere de CD34-positive celler ved hjælp af et CD34-mikroperlesæt i henhold til producentens anvisninger.
EB'er af god kvalitet viste en defineret kant på dag to af differentieringen og fremstod klare og lyse, når de blev observeret under et mikroskop. Tilstedeværelsen af mørkere områder indikerede celledød inden for EB'erne. Efter chiron behandling med varierende koncentrationer på dag to afslørede kvantificering af antallet af CD34-positive celler på dag otte af differentiering cellelinjens respons på behandlingen.
Flowcytometri viste, at den CD34-positive berigelse ved hjælp af de magnetiske perler tilvejebragte ca. 85% CD34-positive celler.
