Om te beginnen, op dag nul, verwarm serumvrij differentiatiemedium of SFD-medium met Mix 1 cytokine tot 37 graden Celsius. Voeg vervolgens, onder een steriele weefselkweekkap, het Mix 1 cytokine-gesupplementeerd medium toe aan elk putje van een celafstotende plaat met zes putjes. Om de cellen voor te bereiden, zuigt u het kweekmedium op uit een plaat met zes putjes die door de mens geïnduceerde pluripotente STAM-cellen of menselijke IPS-cellen bevat.
Was ze met DPBS gevolgd door het opzuigen van de DPBS. Voeg vervolgens het dissociatiereagens toe aan de cellen en incubeer ze een minuut bij kamertemperatuur. Na het opzuigen van dit dissociatiereagens, incubeer de cellen nog eens drie minuten bij kamertemperatuur.
Tik vervolgens 10 keer aan elke kant op de plaat met de cellen om de celclusters los te maken. Voeg per putje een milliliter voorverwarmd Mix 1 cytokine-aangevuld SFD-medium toe aan de cellen. Breng met behulp van een weidepipet de celclusters van elk putje over naar een putje van de celafstotende plaat met het medium met Mix 1-cytokine.
Nadat u de plaat in de couveuse hebt geplaatst, beweegt u deze heen en weer, evenals heen en weer, om de inhoud gelijkmatig te verspreiden en te incuberen voor de vorming van embryoïde lichamen of EB. Draai de volgende dag de celafstotende plaat met de EB's om ze in het midden van de putten te verzamelen. Breng met behulp van een pasteurpipet de EB-suspensie van de putjes over naar een centrifugebuis van 15 milliliter.
Wacht vijf tot 10 minuten totdat de EB's zich op de bodem van de buis hebben genesteld. Was ondertussen de celafstotende platen met steriel water of DPBS om afzonderlijke cellen of vuil te verwijderen. Voeg twee milliliter Mix 1 cytokine-aangevuld SFD-medium toe aan elk putje van de plaat.
Zuig nu voorzichtig het supernatans uit de centrifugebuis zonder de EB's los te maken. Resuspendeer de EB's in het berekende volume SFD-medium dat Mix 1-cytokine bevat. Voeg een milliliter EB-suspensie toe aan elk putje van de gewassen celafstotende plaat die al twee milliliter medium bevat.
Incubeer de plaat na het dispergeren van de EB's door de plaat voorzichtig te bewegen zoals eerder vermeld. Na het verzamelen van de EB's in het midden van de putten, voegt u de chiron toe aan de zijkant van elke put, vermijdt u direct contact met de cellen, incubeer de putten zoals eerder gedemonstreerd. Op dag drie en zes van differentiatie verzamel je de EB's en voer je mediawijzigingen uit, zoals eerder gedemonstreerd voor dag één.
Gebruik SFD-medium aangevuld met Mix 3-cytokines op dag drie en gebruik SFD-medium aangevuld met Mix 4-cytokines op dag zes. Na het verzamelen en bezinken van de EB's van de celafstotende plaat in een centrifugebuis van 15 milliliter, zoals eerder aangetoond, zuigt u het supernatant op en voegt u vervolgens één milliliter celdissociatiereagens toe per putje EB dat in de buis is verzameld om de EB's opnieuw te suspenderen. Breng vervolgens een milliliter van deze EB-suspensie over naar elk putje van de celafstotende plaat die met water is gewassen.
Nadat u de plaat 10 minuten in de incubator hebt geïncubeerd, gebruikt u een P1000-pipet om de EB's in elk putje te dissociëren door niet meer dan 10 keer zachtjes op en neer te pipetteren. Voeg vervolgens vijf milliliter wasbuffer toe per put van gedissocieerde EB's. Verzamel de cellen in een centrifugebuis van 50 milliliter door ze door een zeef van 40 micron te halen.
Na het tellen van de cellen in de gefilterde suspensie, draai je de cellen 10 minuten naar beneden op 300 g. Resuspendeer de cellen in 300 microliter wasbuffer door een paar keer voorzichtig te pipetteren, zodat er geen klonten aanwezig zijn. Ga verder met het isoleren van de CD34-positieve cellen met behulp van een CD34-microbeadkit volgens de instructies van de fabrikant.
EB's van goede kwaliteit vertoonden een gedefinieerde rand op dag twee van de differentiatie en leken helder en helder wanneer ze onder een microscoop werden waargenomen. De aanwezigheid van donkere gebieden duidde op celdood binnen de EB's. Na behandeling met chiron met wisselende concentraties op dag twee, onthulde het kwantificeren van het aantal CD34-positieve cellen op dag acht van differentiatie de respons van de cellijn op de behandeling.
Flowcytometrie toonde aan dat de CD34-positieve verrijking met behulp van de magnetische kralen ongeveer 85% CD34-positieve cellen opleverde.