शुरू करने के लिए, दिन शून्य पर, पूर्व-गर्म सीरम-मुक्त भेदभाव माध्यम या एसएफडी माध्यम जिसमें 1 साइटोकिन को 37 डिग्री सेल्सियस तक मिलाएं। फिर, एक बाँझ ऊतक संस्कृति हुड के तहत, एक सेल विकर्षक छह अच्छी तरह से थाली के प्रत्येक अच्छी तरह से करने के लिए मिक्स 1 साइटोकिन पूरक माध्यम जोड़ें. कोशिकाओं को तैयार करने के लिए, मानव प्रेरित प्लुरिपोटेंट स्टेम कोशिकाओं या मानव आईपीएस कोशिकाओं युक्त एक छह अच्छी तरह से थाली से संस्कृति माध्यम महास्पिरेट.
उन्हें DPBS से धोएं और उसके बाद DPBS की आकांक्षा करें। फिर, कोशिकाओं के लिए पृथक्करण अभिकर्मक जोड़ें और उन्हें एक मिनट के लिए कमरे के तापमान पर सेते हैं. इस पृथक्करण अभिकर्मक aspirating के बाद, कमरे के तापमान पर एक और तीन मिनट के लिए कोशिकाओं सेते हैं.
फिर, सेल क्लस्टर को अलग करने के लिए प्रत्येक तरफ 10 बार कोशिकाओं वाले प्लेट को टैप करें। प्रति अच्छी तरह से कोशिकाओं में पूर्व-गर्म मिक्स 1 साइटोकाइन-पूरक एसएफडी माध्यम का एक मिलीलीटर जोड़ें। एक चरागाह विंदुक का प्रयोग, मिक्स 1 साइटोकिन के साथ माध्यम युक्त सेल विकर्षक प्लेट के एक अच्छी तरह से प्रत्येक अच्छी तरह से सेल समूहों हस्तांतरण.
इनक्यूबेटर में प्लेट शुरू करने के बाद, सामग्री को समान रूप से फैलाने के लिए इसे आगे और पीछे, साथ ही साथ पक्ष में ले जाएं और इसे भ्रूण निकायों, या ईबी, गठन के लिए इनक्यूबेट करें। अगले दिन, सेल विकर्षक प्लेट भंवर ईबी युक्त उन्हें कुओं के केंद्र में इकट्ठा करने के लिए. एक पाश्चर विंदुक का प्रयोग, एक 15 मिलीलीटर अपकेंद्रित्र ट्यूब के लिए कुओं से ईबी निलंबन हस्तांतरण.
ईबीएस ट्यूब के तल पर बसने के लिए पांच से 10 मिनट प्रतीक्षा करें। इस बीच, एकल कोशिकाओं या मलबे को हटाने के लिए बाँझ पानी या डीपीबीएस के साथ सेल विकर्षक प्लेटों को धो लें। प्लेट के प्रत्येक कुएं में मिक्स 1 साइटोकाइन-पूरक एसएफडी माध्यम के दो मिलीलीटर जोड़ें।
अब, धीरे ईबी dislodging के बिना अपकेंद्रित्र ट्यूब से सतह पर तैरनेवाला महाप्राण. मिक्स 1 साइटोकिन युक्त एसएफडी माध्यम की गणना की मात्रा में ईबीएस को फिर से निलंबित करें। धोया सेल विकर्षक प्लेट के प्रत्येक कुएं में ईबी निलंबन का एक मिलीलीटर जोड़ें जिसमें पहले से ही दो मिलीलीटर मध्यम होता है।
ईबीएस को फैलाने के बाद प्लेट को धीरे से प्लेट को इनक्यूबेट करें, जैसा कि पहले उल्लेख किया गया है। कुओं के केंद्र में ईबीएस इकट्ठा करने के बाद, प्रत्येक अच्छी तरह से के पक्ष में चिरोन जोड़ें, कोशिकाओं के साथ सीधे संपर्क से परहेतु, कुओं सेते के रूप में पहले से प्रदर्शन. भेदभाव के तीन और छह दिनों पर, ईबीएस इकट्ठा करें और मीडिया परिवर्तन करें जैसा कि पहले दिन के लिए दिखाया गया था।
तीन दिन पर मिक्स 3 साइटोकिन्स के साथ पूरक एसएफडी माध्यम का उपयोग करें और छठे दिन मिक्स 4 साइटोकिन्स के साथ पूरक एसएफडी माध्यम का उपयोग करें। सेल विकर्षक प्लेट से ईबीएस को 15-मिलीलीटर अपकेंद्रित्र ट्यूब में इकट्ठा करने और बसने के बाद, जैसा कि पहले दिखाया गया था, सतह पर तैरनेवाला को महाप्राण करें, फिर ईबी में एकत्र किए गए ईबी के प्रति एक मिलीलीटर सेल पृथक्करण अभिकर्मक को ईबी में फिर से निलंबित करने के लिए जोड़ें। इसके बाद, इस ईबी निलंबन के एक मिलीलीटर को पानी से धोए गए सेल विकर्षक प्लेट के प्रत्येक कुएं में स्थानांतरित करें।
इनक्यूबेटर में 10 मिनट के लिए थाली ऊष्मायन के बाद, धीरे से ऊपर और नीचे कोई 10 बार से अधिक नहीं pipetting द्वारा प्रत्येक अच्छी तरह से ईबी अलग करने के लिए एक P1000 विंदुक का उपयोग करें. फिर, अलग-अलग ईबी के प्रति अच्छी तरह से धोने बफर के पांच मिलीलीटर जोड़ें। कोशिकाओं को 40-माइक्रोन झरनी के माध्यम से पारित करके 50-मिलीलीटर अपकेंद्रित्र ट्यूब में इकट्ठा करें।
फ़िल्टर किए गए निलंबन में कोशिकाओं की गिनती के बाद, कोशिकाओं को 300 ग्राम पर 10 मिनट के लिए नीचे स्पिन करें। कुछ बार धीरे से पाइपिंग करके बफर धोने के 300 माइक्रोलीटर में कोशिकाओं को फिर से निलंबित करें, यह सुनिश्चित करें कि कोई गुच्छे मौजूद नहीं हैं। निर्माता के निर्देशों के अनुसार CD34 माइक्रोबीड किट का उपयोग करके CD34-पॉजिटिव कोशिकाओं को अलग करने के लिए आगे बढ़ें।
अच्छी गुणवत्ता के ईबीएस ने भेदभाव के दिन दो तक एक परिभाषित बढ़त दिखाई और माइक्रोस्कोप के नीचे देखे जाने पर स्पष्ट और उज्ज्वल दिखाई दिया। गहरे क्षेत्रों की उपस्थिति ने ईबीएस के भीतर कोशिका मृत्यु का संकेत दिया। दो दिन पर अलग-अलग सांद्रता के साथ चिरोन उपचार के बाद, भेदभाव के आठवें दिन सीडी 34-पॉजिटिव कोशिकाओं की संख्या को निर्धारित करने से उपचार के लिए सेल लाइन की प्रतिक्रिया का पता चला।
फ्लो साइटोमेट्री से पता चला है कि चुंबकीय मोतियों का उपयोग करके सीडी 34-पॉजिटिव संवर्धन ने लगभग 85% सीडी 34-पॉजिटिव कोशिकाएं प्रदान कीं।